固相溶血試驗

實驗概要

本文以鼻疽為例介紹了固相溶血試驗(solid phasehemolysis test，SPHLT)的原理及操作流程。

實驗原理

固相溶血試驗是借鑒了單擴散溶血試驗(single  radial hemolysis  test，或稱被動溶血技術)而建立的一項血清學新技術。在紅細胞表面吸附上抗原，與同種抗體作用形成抗原抗體復合物，在補體存在的條件下，通過傳統途徑激活補體，可以使紅細胞發生溶血。如果加入的抗體與吸附在紅細胞表面的抗原不相對應，則不能激活補體，也就不能發生溶血。試驗中，可根據反應孔周圍出現的溶血環直徑大小，進行結果判定。

主要試劑

1. 鼻疽抗原、鼻疽陽性及陰性血清、凍干補體鼻疽抗原作1∶5、鼻疽陽性及陰性血清作1∶2、凍干補體作1∶3稀釋；

2. 1/2萬的鞣酸液；

3. 綿羊紅細胞；

4. 1%瓊脂糖凝膠。

實驗步驟

1.  綿羊紅細胞鞣酸化：綿羊紅細胞用pH值7.2 PBS連續洗3次，每次均為3 000 r/min  3min。取洗過的壓積紅細胞0.4ml，加入pH值7.2 PBS  16ml，制成20%綿羊細胞懸液，使與1∶2萬鞣酸液等量混合，置37℃水浴槽中感作15min，再以pH值7.2 PBS洗3次。

2. 綿羊紅細胞致敏：取壓積的鞣酸化紅細胞與用pH值6.4 PBS配制的鼻疽抗原等量混合，置37℃水浴槽中感作30min，然后用pH值7.2 PBS洗3次。

3. 凝膠盤制備：取抗原致敏的壓積紅細胞33ml，加往融化后冷至55℃1%瓊脂糖凝膠100ml中混勻，澆入塑料反應盤中，每盤約25ml。凝固后，以直徑6mm打孔器在反應盤上打孔兩列，每列5孔。

4. 加入要素及感作：將鼻疽血清和補體等量混合，以微量滴管加入到致敏紅細胞瓊脂糖凝膠反應盤的孔中，每孔0.025ml；然后置室溫下作用3～4h后進行結果判定。

注意事項

1. 補體濃度對SPHLT發生溶血反應的性質有一定影響。補體濃度過高，可單獨引起輕度溶血，檢測陰性血清時，能出現弱溶血反應；若濃度過低，雖為陽性血清，也不能引起足夠強度的溶血反應，易造成假陰性；應用1∶3倍左右的補體則不致造成檢測誤差。

2. 血清抗體的含量與SPHLT產生的溶血環的直徑成正比關系。稀釋度降低，則溶血環直徑增大，反之則減小，為使各種強度的陽性血清均可被檢出，又不與其他血清發生非特異性的交叉反應，采用1∶2被檢血清為適當。

3. 抗原對SPHLT引起的溶血強度，隨抗原濃度而變化，濃度高者，引起溶血反應強，反之則降低。實施反應時以1∶5為適宜。

4. 實施反應時，在15～29℃與4℃下感作，出現的溶血反應強度基本相同，而且于第3～4h即可看到明顯的溶血現象，于第12h稍微增加，延長感作時間，溶血強度也不再增加。因此于第3～4h即可終判。在37℃恒溫箱中感作，溶血現象不明顯，不宜采用這種溫度感作。

5. 對稀釋液的要求不甚嚴格，可用生理鹽水代替PBS，不影響實驗結果。

6. 因為一般瓊脂中含有抗補體物質，瓊脂膠又能在一定程度上阻礙血清的擴散。因此用瓊脂糖較為合適。

7. 在制備反應盤及打孔中的注意事項與固相補體結合反應相同。