四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍
操作步驟
一、接種細胞
1、用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞收集到含血清的培養基中。
　　2、離心細胞懸液，使細胞沉積下來。用培養基重懸細胞，計數。
　　3、將細胞稀釋至2.5×103-50×103 個/ml，每個微滴定板可容納20ml細胞重懸液。
　　4、用加樣器在平底96孔板中間十列的各孔中加入200μl細胞懸液，每孔加0.5×103-10×103 個細胞。
　　5、將200μl培養基加至第1列和第12列的8個孔中。第1 列作讀板議的空白對照。
　　6、將培養板放至塑料飯盒中，于37℃濕潤環境中溫育1-3天，等細胞進入指數生長期時可加入藥物。
二、添加藥物
1、用培養基將細胞毒性藥物5倍系列稀釋，共制備8個濃度。
　　2、對于貼壁生長的細胞，去除第2-11列各孔的培養基。
　　3、在第2列和第11列的8個孔中加入200μl新鮮配制的培養基，這些細胞作為對照。
　　4、在第3-10列的細胞中加入細胞毒性藥物。每個藥物濃度僅需4個孔，這樣A-D行可用于第一種藥物，E-H行用于第二種藥物。
　　5、向每組4 孔中各加入200μl藥物溶液。
　　6、將培養板放回塑料盒中，溫育至確定時間。
三、生長期
1、在藥物作用期結束時，去除所有含有細胞的孔中的培養基，加入200μl新鮮的培養基。
　　2、每日換液至2-3個PDTs[群體倍增時間]。
四、存活細胞數的估算
1、在生長期末，每孔中各加入200μl新鮮的培養基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
　　2、用鋁箔包裹培養板，于 37℃濕潤環境中溫育4 h。
　　3、棄去孔中的培養基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶。
　　4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸緩沖液（每孔25μl）。
　　5、立即在570nm 處記錄吸光值。讀板儀用第1 列中含培養基和MTT但不含細胞的各孔調零。
五、分析
以藥物濃度為橫坐標（X軸），吸光值為縱坐標（Y軸）繪制曲線圖。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值，對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為IC50 濃度。
四唑鹽比色法的原理
活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。
無菌材料
生長液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L，溶于PBSA中）；MTT： 3- (4，5) -雙甲基 - 2 -噻唑 - (2 ，5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml，濾過除菌; Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1mol/L甘氨酸， 0.1mol/L NaCl，用1mol/L NaOH將PH調至10.5 ）；微滴定板（Linbro，ICN）；微吸頭，最好放在高壓滅菌的吸頭盒中。
非滅菌材料
塑料盒（無毒的聚苯乙烯，裝培養板用）；加樣