噬菌體竟然可以保護自身基因組免受CRISPR核酸酶切割

　　細菌和感染它們的病毒正在進行一場與生命本身一樣古老的分子軍備競賽。進化為細菌配備了一系列可靶向并破壞病毒DNA的免疫酶，包括CRISPR-Cas系統。但是，殺死細菌的病毒（也稱為噬菌體）已設計出了它們自己的工具來幫助它們戰勝這些最強大的細菌防御。

　　如今，在一項新的研究中，來自美國加州大學舊金山分校和加州大學圣地亞哥分校的研究人員發現一種引人注目的新策略，一些噬菌體采用這種新策略來避免成為這些DNA切割酶的下一個受害者：在感染細菌后，這些噬菌體在細菌宿主內部構建了一種難以穿透的“區室”，從而保護脆弱的噬菌體DNA免受這些抗病毒酶的侵害。這種類似于細胞核的區室是迄今為止在病毒中發現的最有效的CRISPR屏蔽層。相關研究結果近期發表在Nature期刊上，論文標題為“A bacteriophage nucleus-like compartment shields DNA from CRISPR nucleases”。

圖片來自Nature, 2019, doi:10.1038/s41586-019-1786-y。

　　論文通訊作者、加州大學舊金山分校微生物學與免疫學系助理教授Joseph Bondy-Denomy博士說，“在我們的實驗中，這些噬菌體并不屈服于它們遭遇的任何靶向DNA的CRISPR系統。這是首次在噬菌體表現出這種水平的泛CRISPR抵抗性（pan-CRISPR resistance）。”

　　尋找CRISPR無法切割的DNA

　　為了找到CRISPR抵抗性的噬菌體，這些研究人員從五個不同的噬菌體家族中選出病毒，并用它們感染一種經過基因工程改造以部署四種不同的Cas酶---CRISPR系統中切割DNA的組分---的常見細菌：銅綠假單胞菌。

　　這些經過CRISPR強化的細菌在對抗它們遇到的大多數噬菌體中取得了勝利。但是他們發現兩種巨型噬菌體（jumbo phage）---如此命名是因為它們的基因組比研究最深入的噬菌體的基因組大5到10倍---對所有這四種CRISPR系統都不敏感。

　　這些研究人員決定對這兩種巨型噬菌體進行測試，并探究它們的CRISPR抵抗性的極限。他們將它們暴露于配備了完全不同類型的CRISPR系統的細菌，以及配備僅能靶向有限數量DNA序列的限制修飾系統（restriction-modification system）---一種比CRISPR更普遍的DNA切割酶，這種限制修飾系統存在于大約90％的細菌物種中，而CRISPR僅存在于大約40％的細菌物種中---的細菌。結果和以前一樣：培養皿中散落著被噬菌體感染的細菌爆裂后的殘留物。

　　Bondy-Denomy說，“這真是令人吃驚，這是因為我們對這些細菌進行基因改造，使得它們能大量過量產生細菌免疫系統中的組分，但是它們中的任何一種都不能夠切割噬菌體DNA。這兩種噬菌體對所測試的所有六種細菌免疫系統均具有抵抗性。沒有其他噬菌體能與之匹敵。”

　　巨型噬菌體似乎是堅不可摧的。但是試管實驗表明：事實上，巨型噬菌體DNA與其他DNA一樣，易受CRISPR和限制性內切酶的攻擊。在噬菌體感染的細菌細胞中觀察到的這種CRISPR抵抗性必須是這些病毒產生的某種東西干擾了CRISPR系統的結果。但是，這種東西是什么呢？

　　抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）是一個明顯的罪魁禍首。這些蛋白由Bondy-Denomy于2013年首次發現，是某些噬菌體基因組中編碼的強效CRISPR滅活劑。但是當這些研究人員分析巨型噬菌體的基因組序列時，他們卻找不到抗CRISPR基因。此外，每種已知的抗CRISPR蛋白僅能讓特定的CRISPR系統失去功能，而巨型噬菌體對它們遇到的每種抗病毒酶均具有抵抗性。因此保護巨型噬菌體DNA的東西一定是基于其他機制。

　　發現難以穿透的CRISPR屏蔽層

　　基于顯微鏡的實驗最終揭示了其中的奧秘。當這些巨型噬菌體感染細菌時，它們會在宿主細胞的中間建立一種球形區室，從而將抗病毒酶拒之門外，并為病毒基因組的復制提供“安全室”。

　　經證實，這種球形區室與加州大學圣地亞哥分校的Joe Pogliano教授和加州大學舊金山分校的David Agard教授于2017年首次發現的一種區室結構完全相同。盡管這些研究人員先前已證實噬菌體基因組在這種細胞核樣區室中復制，但直到現在為止還沒有人知道這種區室還可以作為抵御CRISPR和其他DNA切割分子的不可穿透的屏蔽層。

　　盡管如此，關于這種區室和構建它的噬菌體的許多問題仍未得到解答，包括有關構建這種區室的蛋白的基本細節。

　　Bondy-Denomy說，“當對這兩種巨型噬菌體進行測序時，發現了許多假定蛋白（hypothetical protein），而那些用于構建這種區室的蛋白僅是這些假定蛋白中的一部分，但是并不常見。它們甚至在一些相關的噬菌體中也沒有發現。我們也并不知道它們的結構在原子水平下是什么樣子的。”

　　但是，構建這種區室的蛋白基并不是Bondy-Denomy及其同事們渴望解決的唯一謎團。當這些研究人員在顯微鏡下監視被噬菌體感染的細菌時，他們注意到了一種不尋常的現象：在組裝巨型噬菌體的安全室時，這一過程大約需要30分鐘，它的基因組仍保留在被注射到宿主細胞的地方。在這段時間內，巨型噬菌體基因組似乎易受宿主細胞周圍漂浮的任何抗病毒酶的攻擊。但是不知何故，當它的安全室正在組裝中時，它的基因組仍保持完整。

　　Bondy-Denomy說，“我們認為某種區室前體（pre-shell）可以在早期保護注入的DNA。這就像是在區室最終組裝好時就會脫落下來的盔甲。但是我們不知道這種盔甲是什么。”他渴望弄清楚這些巨噬噬菌體如何在病毒生命周期的每一步保護自己免受CRISPR的攻擊。

　　這些研究人員還發現，這種區室并不像最初的實驗所提示的那樣堅不可摧。論文第一作者、Bondy-Denomy實驗室研究生Senén Mendoza通過一些巧妙的工程設計，發現通過將一種限制性內切酶連接到其中的一種病毒區室蛋白上就可繞過這種細胞核樣區室的屏蔽。

　　這種特洛伊木馬策略使得這種切割DNA的限制性內切酶連可以在區室組裝過程中潛入區室內，并在原本被認為是無免疫力的區域內切割噬菌體基因組，從而使細菌得以生存。

　　這項實驗令這些研究人員特別興奮，這是因為它表明實際上有一些方法可以突破這種“難以穿透的”安全室。考慮到細菌和噬菌體一直在尋找破壞對方防御的新方法，Bondy-Denomy認為，科學家們最終將發現細菌已配備了突破或繞過這種細胞核樣區室所需的工具。

　　Bondy-Denomy說，“我們正在尋找細菌繞過這種區室的方法。在這場斗爭中，這絕不可能是最重要的部分。也許有些細菌將一種免疫酶融合到噬菌體蛋白上，然后找到進入這種區室的途徑。或者細菌會偷取噬菌體基因用于抵抗噬菌體。我想我們最終會發現，細菌已想出了很多方法來對抗制造這些區室的噬菌體，我們可能會對它們實現這一點的做法感到吃驚。”