劉光清 劉在新 謝慶閣
(中國農業科學院蘭州獸醫研究所農業部畜禽病毒學重點開放實驗室,蘭州730046)
摘 要: 反向遺傳技術是一種新興的分子生物學技術, 已廣泛應用于生命科學研究的各個領域。綜述反向
遺傳技術研究進展,并討論該技術在口蹄疫病毒研究中的應用。
關鍵詞: 反向遺傳學 反向遺傳技術 全長cDNA 口蹄疫病毒
Reverse Genetic Technique and Its Application in FMDV Research
Liu Guangqing Liu Zaixin Xie Qingge
( L anz hou Veteri nary Research Instit ute CAAS , L anz hou 730046)
Abstract : Reverse genetics is a newly developed technique , and has been applied widely in life science research.
The recent development of Reverse genetic technique was reviewed in the paper. the technique has been applied in Foot2
and2Mouth Disease Virus research ,and the relative progress was also reviewed.
Key words : Reverse genetics Reverse genetic technique Full2length cDNA Foot2and2mouth disease virus
反向遺傳學(Reverse Genetics) 是相對于經典遺傳學而言的,因為經典遺傳學是從生物的表型、性狀到遺傳物質來研究生命的發生與發展規律的,反向
遺傳學則是直接從生物的遺傳物質入手來闡述生物生命發生的本質現象,與之相關的各種技術統稱為反向遺傳學技術( Reverse Genetic Manipulation) 。該技術目前已廣泛應用于生命科學的各個研究領域, RNA 病毒研究的飛速發展更得益于此。以下介紹RNA 病毒的反向遺傳學技術研究進展,并討論其在FMDV 研究中的應用。
1 反向遺傳學操作技術的涵義
由于RNA 病毒在復制表達過程中, 不經歷DNA 階段,所以要進行RNA 病毒的分子水平上的操作,必須首先將RNA 病毒的基因組轉換成cD2NA ,即得到病毒基因組的全長cDNA。然后克隆于合適的載體上,使之受控于強的轉錄啟動子之下,在體外應用RNA 聚合酶轉錄系統,合成病毒基因組的RNA ,再用這些體外轉錄本轉染宿主細胞,使之在宿主細胞內包裝生成具有感染性的病毒粒子,從細胞培養物中回收病毒,得到感染性分子克隆。也可以直接用含有全長cDNA 的表達載體轉染細胞,在體內轉錄生成具有感染性的病毒RNA。在此基礎上,人們就可以根據自己的需要在DNA 水平上對RNA 病毒進行加工、修飾,從而研究病毒基因組的結構和功能,也可以研究病毒的轉錄、表達機制和致病機理等。上述在DNA 分子水平上對RNA 病毒進行操作,進而研究病毒的遺傳規律和生物性狀等的技術即是RNA 病毒的反向遺傳學操作技術。
2 全長cDNA 的克隆技術
反向遺傳學操作技術是在cDNA 水平上進行操作的,因此生物基因組全長cDNA 的克隆就顯得至關重要。在分子生物學技術飛速發展的今天,尤其是在真核生物基因組學領域,獲得全長cDNA 的技術更是日趨成熟和多樣化,原核生物的基因組結構比較簡單,其全長cDNA 的克隆可借鑒于真核生物,目前真核生物基因組全長cDNA 的克隆技術常用的
方法有以下幾種。
2. 1 構建全長cDNA 文庫,從中篩選含有全長cDNA 的克隆目前有多種構建cDNA 文庫的方法可供選擇但其基本原理都是相似的。即oligo ( dT) 結合的纖維素、磁珠或其他固體顆粒,分離純化的mRNA (或含有poly (A) 尾巴的基因組) ,加入酶和反應底物直接進行cDNA 單鏈及雙鏈的合成,然后再將cDNA
進行修飾。削平末端加上接頭,磷酸化后,使之與合適載體相連。
2. 1. 1 cDNA 文庫固相構建法 這是ThomasRoeder 于1998 年在前人的基礎上創新的一種比較好的方法[1 ] 。其原理如下: 5′端生物素化的oligi
(dT) 252primer 連接在鏈霉親和素包被的磁珠上,將總RNA 與磁珠混合后,通過磁性吸附,可進一步分離磁珠2mRNA 復合物,然后以oligo ( dT) 和隨即引物為反轉錄引物DNA 第一鏈,隨后再合成cDNA 第二鏈,用T42DNA 多聚酶削平末端,連上EcoRI 接頭并磷酸化。最后用Not I 酶將cDNA 從磁珠上釋放
下來,與載體相連接,獲得高質量的cDNA 文庫,cD2NA 的大小分布,以oligo (dT) 為引物合成的cDNA ,其大小從300bp～7 Kb ;以隨機引物合成的cDNA ,其
大小范圍在100bp 到7 Kb 之間。
2. 1. 2 oligo2capping 法 針對5′端具有帽子結構的mRNA ,可以采取用細菌堿性磷酸酶(BAP) 去除無5′端mG保護的部分降解的不完整的mRNA 末端的游離磷酸基團,然后再用煙草酸性磷酸酶( TAP) 去除5′的mG結構,僅保留一個5′2 p ,合成一段r2oligo ,用T4RNA 連接酶連接到mRNA 去除了mG以及二磷酸基團的5′2 p 上,繼而利用修飾的oligo (dT) 做反轉錄,并進行PCR 反應,最后克隆到合適的載體上,以建立cDNA 文庫[2 ] 。
2. 1. 3 CAPture 法 這是Ederly 于1995 年報道的一種比較有效的建立全長cDNA 文庫的方法[3 ] 。其原理是利用帽子結合蛋白(CBP) 專門結合mRNA 的帽子結構,使得含有完整帽子結構的mRNA 被富集,以之為模板進行反轉錄, 然后用RnaseA 消化mRNA/ cDNA 雜種鏈,結果沒有被CBP 結合的“部分降解”的不完整的mRNA ,以及雖然結合了CBP ,但并不完整的mRNA 都被降解掉。只有完整的mRNA 又有全長cDNA 第一鏈結合保護的那些mR2NA 得到保護,進一步純化富集后建立cDNA 文庫,其中含有全長cDNA 克隆的比例很高。但是,該方法需要大量mRNA。
2. 1. 4 Cap t rapper 法 Carninci 等[4 ]發明了這種方法,其原理是用過碘酸鹽標記mRNA 的帽子結構,反轉錄合成第一鏈cDNA 后,用Rnase I 除去RNA-DNA 雜合連中的單鏈部分, 這樣非全長的RNA-DNA 雜合鏈就不含有生物素,然后用免疫磁珠法篩選出全長cDNA ,建立cDNA 文庫。其中95 %的克
隆為全長cDNA。該種方法得率和產量較前幾種方法增加10～50 倍,并且由于不需要做PCR 反應,可減少理論上的偏移和冗余性。
2. 2 快速cDNA 末端擴增方法(RACE)RACE 是采用PCR 技術,由已知的cDNA 序列來擴增出完整的cDNA 的3′和5′末端的快速方法,又被稱為單邊PCR 和錨定PCR。現在已有現成的試劑盒供研究者選擇使用,不同的RACE 試劑盒可能會采用不同的策略,但是其基本原理都是一致的。在得到目的基因的5′和3′末端特異性cDNA 以后,可以從兩個相互重疊順序的5′和3′RACE 產物中獲得全長cDNA ,或者可以分析5′和3′端順序,合成相應引物以擴增出全長cDNA。
2. 3 利用穿梭載體獲得全長cDNA
這是Kato 等[5 ]在oligo2capping 技術的基礎上加以改進而發明的一種載體引物法。其最大特點是省略了PCR 和亞克隆等步驟。而且用這種方法得到
的全長cDNA 既能在體外表達,又能在哺乳動物細胞中表達。該方法的要點是構建一種穿梭載體,然后將此載體作成引物直接連在mRNA 的3′末端,做
反轉錄生成cDNA ,用所引入的限制性酶切位點消化后,使之自連,得到全長的cDNA。
3 感染性分子克隆的構建
在克隆到RNA 病毒的全長cDNA 分子之后,可以通過合適的方法轉染宿主細胞以回收具有感染性的病毒粒子,大體上有兩種途徑可達此目的。
3. 1 將全長cDNA 克隆到含有強啟動子的質粒載體上,在體外用RNA 聚合酶轉錄系統進行體外轉錄得到感染性轉錄本(RNA) ,再用轉錄產物感染宿主
細胞,回收感染性病毒粒子。這種方法中啟動子的選擇是很重要的,因為它將影響到體外轉錄本的產量和完整性。人們經常使用的啟動子有: T7 , T3 ,Sp6 等強的啟動子。在使用啟動子的策略上,既可以把全長cDNA 序列克隆到含有這些啟動子的載體中,又可以在合成cDNA 時將啟動子的核心序列與cDNA 的5′端引物嵌合在一起,使得合成的全長cDNA 序列中含有啟動子序列,然后再克隆到載體中。
3. 2 直接用含有cDNA 的質粒(也必須具有強的啟動子如CMV 啟動子) 導入宿主體內,利用宿主的RNA 聚合酶及轉錄系統在體內發生轉錄生成具有
感染性的病毒RNA ,進而裝配成病毒粒子。與體外轉錄相比該方法具有一定的優越性。因為所獲得的RNA 是在體內產生的,對環境的依賴性降低了。另
外在體內產生的病毒RNA 更接近于宿主細胞的mRNA ,可使病毒基因組的表達不依賴于病毒的過程,尤其適用于研究那些不能在細胞內復制的突變
病毒RNA 編碼蛋白的功能和定位。Van Gennip HG等[6 ]為了提高CSFV 的反向遺傳產物的感染性,他們建立了一種穩定的豬腎細胞系,它能表達T7 RNA
聚合酶(SK6. T7) ,在用線性全長c DNA 轉染細胞后,與體外轉錄RNA 相比,病毒的滴度可以提高200 倍,即使用環型c DNA 轉染細胞,也能把病毒的滴度提高20 倍。而且,用這種方法得到的病毒與傳統方法得到的病毒并沒有什么區別。他們由此得出結論SK6T7細胞系可以作為一種有用的工具來回收CSFV 的突變體,對將來的工作極有價值。
4 反向遺傳學操作技術在RNA 病毒研究中的應用
目前,反向遺傳技術在RNA 病毒的研究中已經得到廣泛的應用并取得了很大的成就。對于正鏈RNA 病毒來說,該技術是最先得到成功使用的,已經獲得了脊髓灰質炎病毒、口蹄疫病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒、煙草花葉病毒、蕪菁黃色花葉病毒、登革病毒等的感染性分子克隆。相對而言,負
鏈RNA 病毒的反向遺傳學操作技術就顯得比較滯后。因為負鏈RNA 病毒裸露的基因組或由其cDNA轉錄而來的RNA 沒有感染性。盡管如此,人們仍然
設法得到了一些負鏈RNA 病毒的感染性分子克隆,例如狂犬病毒、牛瘟病毒、新城疫病毒、水皰性口膜炎病毒、人副流感病毒等。其采用的策略主要有兩種:其一是1989 年Luytjel 等[7 ]報道的方法,他們在體外轉錄體中插入來源于流感病毒基因組的調控序列。在體外利用轉錄本和純化的病毒核蛋白以及聚合蛋白獲得具有生物活性的核糖核酸蛋白復合物(RNP) ,在輔助病毒的參與下,轉錄本在導入細胞后得到復制和表達并包裝成為病毒粒子。其二是利用
表達T7 RNA 聚合酶的重組痘病毒、表達RNA 復制和轉錄所需要的病毒蛋白的質粒以及含有病毒cD2NA 的質粒共同轉染細胞,這樣也可以得到感染性的
病毒。獲得感染性分子克隆后,研究者根據其研究的目的,可采取不同的策略在DNA 分子水平上進行操作。總的來說體外操作的方法有基因敲除、基因缺
失、基因插入、基因置換、以及構建嵌和病毒等。反向遺傳技術可以用于基因的克隆測序與定位[8 ] 。還可以用于研究DNA 的同源重組, 例如Sonoda E
等[9 ]用該項技術在DT40 細胞中研究了脊椎動物體細胞內DNA 的同源重組。此外,還可以在DNA 的分子水平上構建嵌合病毒以研究病毒基因組的基因
功能,例如,Dobbe JC 等[10 ]在馬動脈炎病毒感染性cDNA 克隆的基礎上,應用基因工程技術將其主要糖基化蛋白( GP5) 和膜蛋白(M) 用豬繁殖與呼吸綜
合征病毒( PRRSV) 或鼠乳酸脫氫酶病毒(LDV) 的囊膜蛋白替代,研究了GP5 和M 蛋白轉運到高爾基復合體上的過程及其在病毒裝配中的作用,另外還確定了GP5 蛋白在受體識別中的作用。在體外對HAV cDNA 采取基因突變的策略,可能產生具有新的表型的病毒。小RNA 病毒的全長感染性cDNA克隆已經成功構建并用于研究決定病毒至病性的分析,例如在小RNA 病毒cDNA 中2A、3A 編碼區,或者3′端非編碼區進行插入突變的操作,結果產生的病毒子不能在宿主細胞中生長和增殖,而且對溫度敏感。1988 年SVDV 的感染性cDNA 克隆成功構建,為了鑒定豬水皰病毒基因組中決定毒力的基因,Kanno T 等[11 ]在此基礎上,從強毒株和弱毒株的cDNA 克隆制備了一系列重組病毒和定點突變病毒,最后證明基因組中決定毒力的基因在以下兩個位點或其中的一個,一個是2842 位核苷酸,編碼VP1 的132aa ,另一個是3355 位,編碼2A20 位氨基酸。為了確定兩個位點在決定毒力方面的相對重要性,分別在弱毒株和強毒株的這兩個位點進行突變,并在豬體上驗證。研究表明這兩個位點都是決定毒力的位點,但是2A220 則是起主要決定的位點。總之,反向遺傳學操作技術是一門很重要的學科,它的產生與發展必將有力的推動生命科學的發展。
5 反向遺傳技術在口蹄疫病毒研究中的應用
口蹄疫病毒( Foot2and2Mouth Disease Virus ,FMDV) 是一種單股正鏈RNA 病毒,它主要引起偶蹄動物發生口蹄疫,這是一種比較古老而頑固的傳
染病,其流行范圍之廣,控制難度之大,以及對畜牧業之影響卻是其他動物傳染病所無法類比的。而且至今人類尚不能拿到一個切實可行的方法來控制消滅它,因此國際獸疫局將其列為A 類傳染病之首。究其原因主要是人們對該病的致病機理、病毒毒力變異的機制、抗原的漂移性以及該病持續性感染發
生的原因等諸多問題尚不太清楚。因此一直拿不到一種安全有效的新型疫苗來控制口蹄疫,反向遺傳學的興起,對FMDV 的研究起了極大的推動作用,
目前人們不僅已成功獲得了FMDV 的感染性分子克隆,而且應用于口蹄疫研究的各個領域并取得了令人矚目的成就。
5. 1 應用基因突變研究基因功能
為了研究FMDV RGD 序列在病毒感染過程中的作用,Leippert M 等[12 ]在基因組的全長cDNA 分子中,設計了13 個點突變,分別位于RGD 序列內部及其附近區段。在體外轉錄生成cRNA 后, 轉染BHK221 細胞,結果發現在RGD 序列內部發生點突變的cRNA 轉染細胞后,不能產生感染性的病毒粒子,在RGD 附近區段發生突變的cRNA 則能產生感染性病毒。為了進一步證明這些沒有感染性的病毒只是由于在細胞吸附位點上有缺陷, 他們又將在RGD 序列內部發生點突變的cRNA 與表達有野生型P1 蛋白的cRNA 共轉染細胞,結果產生有感染性的病毒粒子,因而也證明了FMDV RGD 序列在病毒吸附過程中具有重組作用。
5. 2 構建嵌合病毒研究基因變異與毒力之間的關系
Sa2carvalho D 等[13 ]構建了一種嵌合病毒,即把兩個不同血清型的O1 株編碼核衣殼蛋白的cDNA序列插入A12 株的感染性cDNA 分子中,構建成一
種新型的雜種病毒,它能表現出原來親本的基因型,通過不斷增加核衣殼蛋白基因的長度比例,研究并分析嵌合病毒在細胞中的生長情況及其毒力的變激酶活性( PKR) 。Chinsangaram J 等[18 ] 為了驗證這一推測,用PKR 的抑制劑22氨基嘌呤處理豬和牛細胞,與沒有處理過的細胞相比,病毒的產量提高了8. 8～11. 2 倍;另外用FMDV 感染通過基因敲除鼠得到的缺失Rnase L - / - 或PKR - / - 的胚胎干細胞,證明PKR 具有抑制FMDV 復制的作用。
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