DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。
原位雜交組織化學技術在近20年的發展可以說是飛躍的，其突出的特點是由分子遺傳學研究提供的探針大量增加，探針生產的可靠性和速率大大發展了，更重要的是非放射性標記物的發展使原位雜交組織化學技術在不久的將來將和現今的免疫細胞化學技術一樣成為實驗室的常規技術和臨床日常應用的診斷技術。新的非放射性標記技術正在繼續不斷涌現。Coulton（1991）建議將非放射性標記技術更名為親合復合物標記技術（Affinity – Complex Labelled Probes, ACLP ）。因為“非（non）“在英文里是一個否定的名詞，而且根據非放射性標記技術的原理是將一個標記物利用其親合性，應用直接或間接的方法結合在核苷酸分子上。
原位雜交組織化學技術在生命科學的研究中可視為一項革命性的技術。它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發育生物學。我們在下節 將詳加敘述。
三、原位雜交組織化學技術的基本方法
如前所述，由于核酸探針的種類和標記物的不同，在具體應用的技術方法上也各有差異，但其基本方法和應用原則大致相同。大致可分為：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visual－ization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。
（一）固定
原位雜交組織化學技術（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA的水平；使探針易于進入細胞或組織。DNA是比較穩定的，mRNA是相對穩定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數月之久不會影響雜交結果。在病理學活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。其它固定劑如應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優缺點，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結構有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態結構，但由于和蛋白質產生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。
（二）玻片和組織切片的處理
1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片應用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放（硅化方法見附錄）。
由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。近年Vector Lab (U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。目前國內尚無生產，需國外進口（配方見附錄2）。
2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據應用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質產生廣泛的交叉連接就需要應用較強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存最和影響組織結構的形態，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。
蛋白酶K（Proteinase K）的消化作用在ISHH中是應用于蛋白消化的關鍵步驟，其濃度及孵育時間視組織種類、應用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應用酶k 1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結構，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報告應用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min進行消化，所獲實驗結果優于蛋白酶K。
不少實驗工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學者卻對此持有異議，根據他們的實驗和經驗證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。 3．減低背景染色和免疫細胞化學染色一樣ISHH實驗程序中，如何減低背景染色是一個重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構成的。雜交后（Posthybridization ）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內源性的RNA酶，減低背景染色。 4．防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實驗室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時，亦可用國內出產的衛生蒸汽消毒鍋（山東新華醫療器材廠生產）。雜交前及雜交時所應用的溶液均需經高壓消毒處理。 （三）雜交（Hybridisation） 在ISHH，整個實驗周期是比較長的，實驗程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個實驗中可被認為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內的靶核苷酸相結合。因此，雜交是ISHH中關鍵的而且是最重要的一個環節 。 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內向正華等采用無菌的蠟膜代替硅化的蓋玻片也可獲得滿意的實驗結果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發。因此，也有為穩妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導致雜交液的污染，必要時可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優點是清潔無雜質，光滑不會產生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發的作用。在孵育時間較長時，為保證雜交所需的濕潤環境，可將復有硅化蓋玻片進行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進行孵育。雜交液的成分和預雜交液基本相同，所不同的是加入了標記的核酸探針和硫酸葡聚糖（配方見附錄）。 如前所述，雜交前的準備只是為雜交的成功奠定基礎，要獲得滿意的實驗結果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環節 。 1．探針的濃度很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關。根據國內外實驗工作者的經驗，認為最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結合度為目的。這和我們在免疫細胞化學試驗中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。 探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，根據筆者的經驗及所查閱文獻，在原位雜交細胞化學中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。根據Heinz 、Hofelt實驗室經驗，對放射性標記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認為生物素標記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實驗室應用于放射性標記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標記（生物素或地高辛）cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應用地高辛標記生長抑素cRNA探針獲得滿意結果，其探針濃度為0.5ng/μl。 必須強調的是，國內外實驗室都證明加雜交液的量要適當，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導致高背景染色等不良后果。 2．探針的長度一般應用于ISHH探針的最佳長度應在50～100個堿基之間。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。據報告，長500個堿基的探針，其雜交時間約需20h左右。200～500個堿基的探針仍可應用，如超過500個堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數。 附：核酸探針水解法（以放射性標記探針為例） （1）按下列比例混合 探針溶解于水 160μl無菌蒸餾水加入含標記探針沉淀物的Eppendrof管中 0.4mol/L NaHCO3 20μl 0.6mol/L Na2CO3 20μl 混合后孵育于60℃水浴，其孵育時間由下式推算： 孵育時間= LO –Lf/K×LO–Lf LO：核酸探針原長度（Kb） Lf ：核酸探水解后所需長度（Kb） K：是一常數0.11Kb/min （2）在室溫中加入下列配方以終止水解 3mol/L 醋酸鈉 6.6μl(最終濃度0.1mol/L) 醋酸1.3μl(最終濃度0.5%) （3）加下列配方沉淀探針 7mol/L 醋酸銨100μl 100%乙醇750μl tRNA(10mg/ml) 2μl 置于—20℃2h后回暖至室溫，在14000rpm離心30min。 （4）小心將乙醇輕輕傾出，待試管內干燥后再用無菌蒸餾水稀釋到10ng/μl濃度。 （5）應用放射性標記測定法測定其放射比活性（詳見第十九章 ），然后調到5ng/μl濃度。 3．雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環節 。在第十八章 概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（melting temperature, 簡稱Tm）。原位雜交中，多數DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對保存組織形態完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報告，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調節 鹽濃度的辦法來調節 Tm。Tm的計算公式在第十九章 有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關。由于鹽和甲酰胺濃度的調節 等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細胞內靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，（有作用報告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復性，再置入盛有2×SSC的溫盒內，在37～42℃孵育雜交過夜。 雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應時間在3h左右。Barns等（1987）報告用DNA探針雜交，其反應完成時間為2～4h。但為穩妥起見，一般將雜交反應時間定為16～20h，或為簡便起見雜交孵育過夜，從現有文獻報告看無不良結果。當然，雜交反應的時間與核酸探針長度與組織通透性有關，在確定雜交反應時間應予考慮，并經反復實驗確定。 有作者主張雜交反應的孵育應在黑暗環境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。 4．雜交嚴格度（Hybridization stringency）雜交條件的嚴格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch）雜交的穩定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。一般來說，低嚴格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm -35℃至Tm –40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結合，其結果是導致非特異性雜交信號的產生。中嚴格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩定的結合。麥躍行裝用地高辛標記原位雜交技術檢測尖銳濕疣中人乳頭瘤病毒DNA型別，結果發現在嚴格條件下（Tm-12℃）各型病毒DNA的檢出率和陽性率明顯低于非嚴格條件下（Tm-35℃），其相差非常明顯（P<0.001）。因為，在嚴格條件下只有同源性很強的DNA才被檢出，而在非嚴格條件下同源性較低的DNA序列也被檢出。因此，他建議對病毒DNA分型需在高嚴格條件下進行，而低嚴格條件則可用于對病毒感染進行篩選。 由于原位雜交技術多數是在Tm-25℃進行的，不屬于高嚴格范圍，無疑會產生非特異性結合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩定性，應用cRNA探針進行細胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。 5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide）硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合（hydrate）作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。 甲酰胺的主要作用在上節 已提及，在調節 雜交反應溫度方面，甲酰胺起了極為重要的作用，從而有助于保持組織的形態結構。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩定的作用。