單克隆抗體上清制備實驗——大量制備

目的雜交瘤

完全 DMEM-10 培養液（含 5～10 mmol／L HEPES　pH 7.2～7.4）

250 ml 無菌錐形離心管轉瓶培養裝置850 cm2 旋轉培養瓶175 cm2 組織培養瓶

1. 重復基本方案 1 步驟 1，并按 1:10 分傳到終體積為 100 ml 的完全 DMEM-10/ HEPES 中。

2. 準備傳代細胞時，應將 175 cm² 培養瓶中的內容物（100 ml) 轉移到一個 850 cm² 旋轉培養瓶中，另加 150 ml 完全 DMEM-10/HEPES，蓋緊瓶蓋，置于轉瓶培養裝置上于 37℃ 培養 1～2 天。

3. 用飽蘸 70% 乙醇無菌海綿擦拭旋轉培養瓶的瓶蓋和瓶頸，打開瓶蓋，加入 250 ml 完全 DMEM-10/HEPES，蓋緊瓶蓋，再在轉瓶裝置上培養 1～2 天。

4. 如步驟 3 所述擦拭瓶蓋及瓶頸。打開轉瓶，加入大約 2L 的完全 DMEM-10/HEPES 直至幾乎滿了（總體積約 2.5L)。為了避免泡沫，先加入無血清培養液，最后加入 FCS 至終濃度為 10%。蓋緊瓶蓋，并置轉瓶培養裝置上，37℃ 培養直至培養液變黃色（大約 5 天)。

5. 將培養液倒入無菌的 250　ml 的錐形離心管中，室溫下 250 g 離心 20 min, 收集上清并分裝凍存。如果上清不準備用于生物學檢測，可加 10% 疊氮鈉溶液至終濃度為 0.02%。如果上清準備進行親和層析或鹽分級沉淀，那么最好先經 0.45 μm 濾器濾過除菌，以清除碎片。

每個 175 cm² 培養瓶中的培養物最終可以接種到 2.35～2.5 L 的培養液中。如果用蛋白親和層析法從上清中純化 MAb，可期望得到 1～10 mg MAb/L。通常不必將細胞放入無血清的培養液中適應和培養（這種做法常會降低產量）。如果用蛋白質 A-親和層析法從上清中純化 MAb, 應該單獨檢測使用 FBS 的培養液是否有污染，即被其他蛋白污染），污染物有可能與 MAb 同時被純化。新生胎牛血清常含有顯著量的 1 g，它將與蛋白質 A 結合，因此這種血清不可以用于配制培養液。