華大智造：我們的這種測序方法吊打傳統MPS

　　在生物醫學大數據的重要價值日益凸顯的今天，大規模組學計劃成為世界各國的重要戰略布局，如何能夠更準確、更快速、更低成本地開展基因測序變得愈發迫切，驅動著技術之輪飛馳向前。高通量測序誕生和發展的歷史，鐫刻著科學家和產業先驅們在“更準、更全、更快、更便宜”的道路上所作出的種種努力。近日，由華大智造聯合浙江大學沃森基因組科學研究院等團隊共同完成的一項研究成果于bioRxiv發布了預印本（https://doi.org/10.1101/2020.02.19.953307）。該研究向我們展示了一種全新的、基于抗體的高通量測序方法——CoolMPS?，并介紹了它相比于傳統技術的一些突出的特性和優勢。據悉，目前該技術已成功轉產并推向全球市場，不僅為廣大基因組學的研究者提供了更多選擇，也有望推動高通量測序技術的加速發展。

　　那么，該技術包含著哪些獨特的創新，它又如何克服傳統基因測序方法的局限？故事的開頭，要從大家最熟悉的A、T、G、C（組成核苷酸的堿性基團）開始說起……

　　一、傳統方法的局限與CoolMPS?的創新

　　在目前最為流行的大規模平行測序（MPS）平臺中，為了測定堿基類型，我們將熒光染料標記的四種可逆終止核苷酸（RTs）加入反應體系，進而讀取熒光信號。然而，這種加工過的核苷酸不僅帶來了額外的成本，也有可能在洗脫步驟出現部分熒光染料基團化學結構殘留在新合成核苷酸鏈上的現象，這些殘留的化學鍵——或者說“疤痕”——可能影響新合成鏈的柔韌性和聚合酶對鏈的持續延伸的結合效率及聚合酶的保真性，還有可能部分淬滅在下個循環上的熒光信號，從而影響測序的質量。換言之，這些經過加工的核苷酸，雖然為測序帶來了便利，卻也埋下了 “偏差”（bias）的種子。

　　“清水出芙蓉，天然去雕飾。”我們能否利用未經修飾的天然堿基進行測序呢？在抗體技術的幫助下，這一想法成為了現實。作為一種新型的MPS測序體系，它借助未標記的RTs與四種熒光標記的、能與天然堿基特異性快速結合（30秒）的抗體的配合，得到了極為優異的表現。具體步驟如下：第一步，加入未標記可逆終止核苷酸；第二步，堿基互補配對完成后，加入熒光標記的，能與（上一步加入的）3'-阻斷的核苷酸特異結合的抗體；第三步，洗脫多余的抗體，在基因測序儀上成像，進行堿基識別；第四步，洗脫抗體和3'-阻斷基團，得到天然無疤痕的核苷酸，進入下一個循環（見圖1）。

圖1 CoolMPS?流程

　　抗體堪稱生命科學研究的“神器”，它的優勢在CoolMPS?技術中也體現得淋漓盡致。概括來說有以下四點：

　　1. 信號強

　　每個抗體能結合多個熒光分子，堿基信號更強，相同拷貝數的DNB用CoolMPS?可以獲得更高的信號和更高的信噪比，從而使測序更準確。圖2顯示了在多個循環中使用兩種測序通用反應試劑（分別基于CoolMPS?方法和標準方法，即將熒光染料直接標記在ddNTP上）的信號強度比較，CoolMPS?的信號強度遠高于傳統高通量測序試劑。更強的信號也意味著，我們有機會在更低的起始量下進行測序，未來或可實現在更小DNB（例如<100nm）的超高密度DNB納米陣列上進行MPS。

圖2 測序時CoolMPS?的信號強度與標準方法（Standard MPS）的比較（a）及兩種方法的預計錯誤率（b）

　　2. 避免了非天然堿基帶來的熒光淬滅

　　在傳統的高通量測序方法中，聚合的堿基上會留下多余的化學鍵（即前文提到的“疤痕”），可能會影響待測堿基上的熒光信號，進而影響測序的準確性。CoolMPS?方法中新合成鏈的堿基為天然堿基，不會因為堿基上的疤痕而影響熒光信號，最終獲得更高的準確性和更長的測序讀長。

　　3. 反應更完全，測序讀長更長

　　DNA聚合酶在生物體內的底物是天然dNTPs。雖然經過突變體的改造，DNA聚合酶也能加堿基上有龐大熒光基團標記的dNTPs，但其反應效率遠遠不如加堿基上沒有標記的dNTPs。此外每一輪反應接近100%的完成率也是進行更長讀長的短讀測序的必要條件，否則信號會呈現指數下降，產生測序錯誤。

　　為了探索CoolMPS?能否測得更長，研究團隊進行了SE400的測序實驗。Q值的分布如圖5所示。前300個堿基的錯誤率僅為0.14％。如果增加每個DNB的拷貝數和每個抗體上帶的染料分子，進一步減少lag和runon（*注：lag和runon是用來衡量測序反應是否完全的指標。lag是指測序進行到N位置時，其某些拷貝才反應到N-1位置的比例；而runon則指某些拷貝已反應到N+1位置上的比例），有望實現更高質量、更長讀長的CoolMPS?測序，甚至可能達到Sanger測序的讀長（例如500-700個堿基）。

圖3 CoolMPS? SE400的堿基Q值分分布隨循環數的變化

　　4. 抗體已廣泛用于診斷測試和治療，對抗體本身的研究已經非常深入

　　有許多成熟的技術可以進一步幫助CoolMPS?方法的進一步優化，包括小分子抗體如ScFv或納米抗體替代完整抗體等。這表明CoolMPS?還將具有更大潛力和可挖掘價值。同時，在成本控制方面，CoolMPS?也有著很大的潛力。

　　二、初露鋒芒：CoolMPS?多場景應用數據

　　大規模并行測序中，測序讀長超過100bp對下游的信息分析非常有用。文章首先展示了SE200測序的熒光信號強度、錯誤率隨測序循環數變化的趨勢，以及關鍵性能指標（錯誤率在185個循環之后增加很快，這是由于測到了接頭序列，這些接頭無法比對到人類參考基因組上）。

圖4 SE200的信號強度（a）、錯誤率（b）和性能指標（c）

　　而對于目前使用最為廣泛的雙端測序（PE150）而言，研究團隊使用大腸桿菌和人的樣本進行測試，數據顯示，Read1比對率> 99％，錯誤率分別為0.08％和 0.26％；Read2比對率約為 99％，錯誤率分別為 0.22％和 0.62 %。在過濾掉質量值少于10 的read后（分別約為 0.4％和 0.8％），錯誤率分別降為 0.06％和 0.24％。這些結果反映了CoolMPS?方法的準確性和可靠性。

圖5 PE150測序信號強度（a）和關鍵性能指標（b）

　　除文章展示的測試結果之外，研究團隊的其它測試也有助于我們了解CoolMPS?的特點。在一項使用MGISEQ-2000平臺和CoolMPS?技術對FFPE標準品Horizon HD200進行靶向測序的實驗中，基因組比對率>99%，Q30>92%，并且檢測位點突變頻率相對于平行進行的標準方法（StandardMPS）來說，與理論頻率的相關性更高。

圖6 StandardMPS與CoolMPS?的突變頻率與理論突變頻率的相關性

　　包括上述測試在內的大量實驗結果，為CoolMPS?的產品化打下了堅實的基礎，目前該技術在華大智造測序平臺MGISEQ-2000（DNBSEQ-G400）上已經可以可使用，并在一些研究中嶄露鋒芒。讀者可以通過該公司官方網站（https://www.mgitech.cn/products/reagents_info/37/）做進一步了解。

　　三、小小抗體，大有玄機

　　CoolMPS?的優良表現，與高質量的抗體密不可分。首先，準確的測序要求抗體對 3’被可逆阻斷的核苷酸具有特異性。為了證明每種抗體對每個堿基都是特定的，研究團隊創建了DNB陣列，并與引物雜交，然后用一個可逆終止子延長一個核苷酸。結果顯示表明，與4個標記抗體結合后，在單一成像場中DNBs群體的熒光強度不顯示任何抗體交叉結合，說明抗體具有良好的特異性。

　　其次，抗體的結合需要 3'端有疊氮甲基阻斷基團，這樣能夠確保抗體結合到我們希望讀取的特定堿基上。圖7顯示了抗體與DNBs 孵育時的熒光強度。在前三個正常的cycle中，核苷酸上存在著疊氮甲基阻斷基團，此時所有四種抗體都產生了強信號（400-600個計數）。從第四個cycle開始，每個cycle在抗體結合前都切除了3 '疊氮甲基阻斷基團，此時無法檢測到明顯的信號。這表明除了堿基外，阻斷基團對抗體的牢固結合也是至關重要的。抗體和堿基的牢固結合可能會阻止抗體與DNA中的其他靶標堿基結合，從而提升測序的準確性。

圖7 左：抗體與DNBs孵育時的熒光強度； 右：標記抗體和標記RTs的熒光信號強度，前20個cycle使用堿基標記的核苷酸，之后60個cycle使用抗體標記，最后再使用堿基標記的核苷酸

　　研究團隊通過反復的摸索和實驗，證明只要4ug/ml的抗體，僅需30秒就能結合大多數新摻入的3’端可逆阻斷核苷酸，從而產生足夠的信號進行堿基檢出。研究人員還發現，高pH值（>pH8）和高于55℃的溫度可以有效地切除一定量的抗體，在切除試劑中加入未標記的RTs可以加速分離。不含RTs的緩沖液條件與疊氮甲基裂解反應可兼容。這意味著抗體切除能夠和3 '阻斷基團切除同時進行，大大提高時間效率。

　　最后，標記抗體可以比標記RTs得到更強的信號。為防止熒光淬滅，標記的RTs只能有一種染料附在一個堿基上。為了減少堿基“疤痕”的負面影響，通常標記只達到60-70%。而CoolMPS?的每個抗體可以標記多個染料分子，實驗表明，相對于堿基標記的核苷酸，抗體檢測產生了更強的信號，一些熒光團產生了比堿基標記高出300%以上的信號強度。增加強度的好處包括：在長時間的測序過程中，在高密度納米陣列的低模板拷貝DNBs中得到足夠的信號；減少暴露或實現更快速的成像。

　　在高質量抗體的幫助下，CoolMPS?在基因測序儀的二色成像系統上進行“四色”測序成為可能。我們知道，傳統的四色熒光測序中，A、C、G、T 分別對應不同的四種熒光，這種測序方法受限于熒光染料的光譜重疊及對濾光片的要求。常規的二色熒光測序克服了四色熒光的缺點，僅利用光譜距離更遠的兩個熒光來識別兩個圖像中的四個堿基。但缺點是，為一個堿基分配一個空強度值，一個堿基是兩種顏色的混合。這仍然可能導致堿基的重疊。CoolMPS?首先一次加兩個熒光抗體，讀取信號，去除；隨后加入另外兩個熒光抗體，讀取信號，獲得四個不同的圖像（每個堿基一個）。也就是說，這種方法可以在配備二色成像系統的基因測序儀上達到“ 四色測序”的效果（4CS2CI）。測試結果表明， CoolMPS?測序引入的這種方法幾乎消除了染料串擾，將G到C的錯誤降低了52.2倍，使得C的平均錯誤率極低（0.00045％），并且原始讀取的G（0.00070％）的錯誤率，比標準4CS4CI CoolMPS?低一個數量級。

圖8 利用CoolMPS技術分別在四色成像系統（4CS4CI）和二色成像系統（4CS2CI）的測序結果對比

　　四、展望：開拓大規模平行測序的新天地

　　通過對文章的解讀，我們可以看到，基于抗體的CoolMPS?測序方法為急速發展的高通量測序技術開拓了全新的方向，優異的測試結果為我們揭開了基因測序技術實現跨越升級的美好愿景，激勵著研究者們沿著這一思路進行更多探索和嘗試。CoolMPS?試圖從根本上改革傳統測序方法中信號讀取的局限性，大膽地使用熒光標記抗體來代替熒光標記的核苷酸，并在化學過程、信號讀取、數據質控等多個層面進行了大量測試，體現了銳意創新和嚴謹求證的有機結合。

　　可以預見的是，這項新型測序技術將全面提升華大智造DNBSEQ系列測序系統的性能、質量、實用性和性價比，為基因組學研究和應用創造更多可能。隨著CoolMPS?技術在DNBSEQ測序平臺上的大規模使用，測序行業通用的質控指標（如讀長、錯誤率等）有望在新技術的驅動下進一步升級，這也勢必會帶來更高的行業標準，北美乃至于全球測序市場的產業競爭格局也將迎來新的變化。日趨激烈的技術競爭推動著高通量測序的邊界不斷拓展，更多的生命科學和醫學研究將因此而獲益。

　　與此同時，我們也應清楚地認識到，CoolMPS?還有著廣闊的提升空間，能否進一步減少信號損失和異相讀取？能否繼續提升化學反應的性能，增加信號的強度？在二色或一色成像儀系統上進行高精度的“四色測序”能否得到推廣？眾多問題呼喚著國內外研究者去回答，期待以上這些問題能夠在不久的將來得到答案。實踐是檢驗真理的唯一標準，希望包括CoolMPS?在內的基因組學領域的最新研究成果和前沿技術，能夠激發出更多創新和更廣泛的實踐，助力基因測序為人類健康水平的提升作出更多貢獻！