化學鍵合相色譜儀的固定相是通過化學反應將各種不同的有機基團以共價鍵連接到色譜柱載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層。化學鍵合相色譜儀有正相鍵合相色譜儀和反相鍵合相色譜儀。
一、正相鍵合相色譜儀分離原理：
正相鍵合相色譜儀使用的是極性鍵合固定相。極性鍵合固定相是全多孔型或表面多孔型微粒硅膠載體經酸活化處理后制成表面含有大量硅羥基的載體，再與含有胺基（NH2）、腈基（-CN）和醚基（-O-）的硅烷化試劑反應，生成表面具有胺基、腈基和醚基的極性固定相。溶質在此類固定相上的分離機理屬于液液分配色譜。
二、反相鍵合相色譜儀分離機理：
反相鍵合相色譜儀使用的是非極性鍵合固定相。非極性鍵合固定相是全多孔型或表面多孔型微粒硅膠載體經酸活化處理后與含有烷基鏈（C4、C8、C18）和苯基的硅烷化試劑反應，生成表面具有烷基或苯基的非極性固定相。
目前，反相鍵合相色譜儀分離機理有兩種論點：一種認為屬于液液分配色譜，另一種認為屬于液固吸附色譜。
液液分配色譜分離機理是假設在由水和有機溶劑組成的混合溶劑流動相中，弱極性有機溶劑分子中的烷基官能團吸附在非極性鍵合固定相表面的烷基基團上，而溶質分子在流動相中被溶劑化，并與吸附在固定相表面上的弱極性有機溶劑分子進行置換，從而構成溶質在固定相和流動相中的分配平衡。
液固吸附色譜分離機理認為溶質在非極性鍵合固定相上的保留是疏溶劑作用的結果。根據疏溶劑理論，當溶質分子進入極性流動相后，即占據流動相中相應的空間而排擠一部分溶劑分子。當溶質分子被流動相推動與非極性鍵合固定相接觸時，溶質分子的非極性部分或非極性分子將非極性鍵合固定相上附著的溶劑膜排擠開，直接與非極性鍵合固定相上的烷基官能團結合（吸附）形成締合絡合物，構成單分子吸附層。這種疏溶劑的斥力作用是可逆的，當流動相極性減少時，疏溶劑斥力下降，發生解締，并將溶質分子釋放而被洗脫下來。