具有高分辨、高靈敏度和高通量等優勢的超高效液相色譜技術（UPLC），特別適合監控流動反應及開發優化條件。本文以DMF體系升溫條件下向3,4-二氟硝基苯中加入嗎啉的流動反應為例，通過對反應體系流出液取樣和監測，對連續流動反應中的起始原料、終產品和潛在雜質的存在情況和動力學參數進行表征，并在優化反應條件下建立對低含量雜質或中間產物的UPLC分析法。
采用連續流動化學系統來優化化學合成工藝，既可提高產量和產率，又易于擴展和控溫，且制造過程更安全。確定流動反應的最佳條件至關重要。作為流動反應過程的一部分，最終產物反應動力學特征按溫度、壓力、線圈停留時間和反應物計量來描述。但信息均在反應后獲得，使反應過程不連續，且非常費時，而離線分析會影響到結果，為了改善反應時間線和定量的可靠性，采用在線監測技術更為有利。
光譜法或紫外法一直被用于定量主要產物，但方法產生的低含量雜質或中間產物以及形成動力學方面的信息很少。通過采用定量分離技術，如在線LC可顯示關于最終產物和低含量雜質，同時自動化流動反應。既能充分了解反應情況，也可改善流程，保證最大產率和最高純度。
超高效液相色譜（UPLC）非常適合監測流動反應的優化過程。該技術具有高分離度、高靈敏度和高通量等優勢。分析分離效率隨色譜柱中顆粒直徑減小而增加。其優化線性速度隨顆粒尺寸變小而增加。因此，色譜分離的運行會更快速且不影響分離度，同時該技術可快速和準確地描述流動反應的動力學特征。采用UPLC作為反應優化的傳感器，需通過收集來自塞流反應的洗脫液和通過生產線取樣分析完成自動開發監測反應物種的分析方法。一旦UPLC方法的條件成立，系統就會直接配置為在線取樣流式反應器，反應條件被改變，以量化最終產物和過程雜質的最終濃度的影響。再利用該數據來確定最佳的流動反應條件。UPLC分析方法同樣可用于監測流動反應從臺式到試驗到制造規模的擴展情況。
測試方案
測試對象
在DMF體系中，升溫條件下向3,4-二氟硝基苯中加入嗎啉，進行流動式化學反應工藝過程，反應式見圖1。
圖1. 向3,4-二氟硝基苯中加入嗎啉的化學反應方程式。
測試系統及流程
流動反應在Uniqsis FlowSyn系統上進行，并通過PATROL UPLC實驗室分析器系統對反應流出液取樣和監測。為便于分析方法的開發，將FlowSyn配置為塞流分析，即將反應物注射入反應線圈，再通過流份收集器（可選配置）收集流份。樣品由實驗室分析器系統進行在線分析，開發可用于定量反應原料、終產物以及可能雜質的UPLC方法。一旦分析方法經過優化，實驗室分析器系統可直接配置為FlowSyn系統的出口，等份樣品被自動采樣并以在線模式進樣到UPLC系統分析。
圖2. 篩選塞流實驗樣品的分析結果，產生最佳峰形和分離度的分離條件將被進一步優化。
分析方法
分析方法開發的色譜條件
系統： PATROL UPLC實驗室分析器系統；數據分析： Empower 2軟件；
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18 2.1×50mm 1.7μm，ACQUITY UPLC BEH Phenyl 2.1×50mm 1.7μm，ACQUITY UPLC HSS T3 2.1×5mm 1.8μm，ACQUITY UPLC HSS C18 2.1×50mm?1.8μm；樣品：DMF中的反應等份物；進樣量：2μl；溫度：40℃；流速：600 μl/min；洗脫液A1：10mM 甲酸銨pH 3；洗脫液A2：10mM碳酸氫銨 pH 10；洗脫液B1：乙腈；洗脫液B2：甲醇；梯度：5% ~ 95%B，洗脫2min以上；檢測：245nm，20Hz正常；樣品沖洗：30s；稀釋：100倍；針洗：5s，60：20：20 乙腈/二甲基甲酰胺/水溶液。
表1. 流動反應優化變量及其對終產物和過程雜質相對數量的影響
最終色譜法
系統：PATROL UPLC實驗室分析器系統；數據分析： Empower 2軟件；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1×5mm 1.8μm；樣品：DMF中的反應等份物；進樣量2μl；溫度：60℃；流速：1ml/min；洗脫液A：10mM 甲酸銨pH 3；洗脫液B：甲醇；梯度：35%~75%，洗脫30s以上，保持15s；檢測：245nm，40Hz正常；樣品沖洗30s；稀釋：100倍；針洗：5s，60：20：20乙腈/二甲基甲酰胺/水溶液。
圖3. 流動反應媒介的最終梯度分離。
結果與討論
UPLC分析方法的開發與優化
開發分析方法，需確保反應流出液含有未反應的初始原料、最終產物以及任何可能存在的反應副產物。按事先設計的分析篩選方案篩選pH條件和有機溶劑種類，通過選配的色譜柱管理器還可篩選不同的色譜柱，以達最佳分離條件。經初次篩選，最佳分離結果由低pH值緩沖液、甲醇以及HSS T3色譜柱的組合獲得，如圖2所示；通過二次篩選方案進一步優化，分析時間僅為45s，整個進樣間隔時間（包括采樣、稀釋及軟件處理時間）為2.6min，如圖3所示。
圖4. 考察每組反應條件時，至少在穩態下取三個樣品可確保每個反應組分的定量可重現。
流動反應的參數評估與優化
Uniqsis FlowSyn系統 專門用于自動化的流動反應工藝開發，可設置實驗矩陣進行，以評估線圈溫度、化學反應計量、線圈內停留時間對最終產物的產率和純度的影響。將該系統與實驗室分析器系統連接，可自動檢查每項反應條件。對每組條件，應在其反應穩定狀態下收集足夠數量的樣品，以確保實現定量可重現（如圖4所示）。由于通過開口管的液體層流在實驗開始和結束時都會使反應物分散，因此達到反應穩態的時間取決于反應線圈的幾何參數（長度和內徑）。將該時間與在穩態下實現充分重復進樣所需的時間相加，以確定在自動化實驗中反應條件的改變時間。UPLC方法的最終運行時間為45s，采樣和稀釋額外需要的時間使進樣循環時間增加到2.6min。在自動化實驗中，每組反應條件都保持25min，以確保穩態下足夠的進樣次數。
生成一個反應變量矩陣，以檢查線圈停留時間、反應溫度和和反應物計量的影響。方法開發矩陣列示在表1中。變量可以編程至Uniqsis FlowSyn系統中，對序列進行初始化，在線樣品自動采集支持無人值守運行。
圖5. 每個流動反應變量及其對終產物（藍）和過程雜質（紅）形成的影響趨勢圖。
序列完成時，兩個系統均被程控為自動沖洗并停機。對最終色譜數據進行分析，以確定每個反應變量對終產物和過程雜質產率的影響，最終相對數量列于表1，變量的變化趨勢如圖5所示。該數據可以用于計量學分析，以確定最佳反應條件。最終的反應條件確定為1.5倍過量的嗎啉、11min線圈停留時間和100℃的線圈溫度。這將使最終產物的產率最大，形成的過程雜質最少。
最終流動反應條件可放大至中試、車間或工廠生產規模，且PATROL UPLC過程分析器系統可用在制造車間進行監測。
小結
通過分析反應流出液的等份物，PATROL UPLC實驗室分析器系統可監測流動反應的條件開發和優化。檢測結果可反映所有變量的動力學特征，包括低含量水平的過程雜質。系統可輕松與自動臺式流反應器Uniqsis FlowSyn系統連接，所開發的監測流動反應的方法可轉換至PATROL UPLC工藝分析器系統，監測生產車間中的流動反應。