蛋白質經過重折疊和過濾后，最后一步的高分辨率離子交換層析柱用于完成 下 面 5項重要工作。
⑴ 濃 縮 蛋 白 質 ( 如 從 600 m L 濃 縮 到 4? 8 m L )
(2) 去除變性劑(在流穿液中）
(3) 去除次要的雜質(在流穿液中，或是與柱子的結合弱于或強于與目標蛋白質的結合) 如果使用高分辨的陰離子交換柱，如 p〇 R〇 s H Q 或 M〇 n〇 Q，任 何 D N A 污染物都會緊密結合在柱子上，使用〇 ? 6?〇 ? 9 mol/L 的 NaCl可以洗脫下來。如果非常希望在終產物中沒有大腸桿菌的脂多糖，可以在開始用鹽濃度梯度洗脫之前用異丙醇 (isopropanol)沖洗柱子以大大減少LPS。
(4)選擇均一的，有活性的單體如果有通過非重折疊技術純化的天然蛋白質的樣品，那么就能知道在同樣的離子交換柱上用何種鹽濃度可以將其洗脫。如果在相同的鹽濃度下，重折疊樣品洗脫出了一個主要的峰(peak), 那么就可以部分地確信該蛋白質得到了正確重折疊，因為如果使用的柱子具有高分辨率，那么錯誤折疊的分子可能會有(但不是一定的)略微不同的洗脫結果。
(5) 除去可溶的蛋白質多聚體在重折疊樣品中常有可溶的多聚體(見 本 章 5.7節）。如果你選擇的重折疊溶液很合適, 那么多聚體也可能會極少; 否則，它們會是重折疊產物的主要成分。這 些 可 溶 的 N 聚體與單體相比帶有JV倍的電 荷 。由于有更多的電荷 ，其傾向于與離子交換柱結合得更緊密，洗脫下來也更晚。如果蛋白質是用于結晶以測定結構，去除多聚體是很重要的一步, 因為不均一相的材料不大可能結晶。
以我的經驗，大多數情況下，從柱子中洗脫出的第一個主峰中的蛋白質都會是髙品質的、純的、具有完整生物活性的蛋白質。
如果你的蛋白質不含半胱氨酸，這就不是問題。然
而 , 大部分蛋白質都含有半胱氨酸
，而且許多都有作為三維結構重要組成部分的二硫鍵。由于大腸桿菌的胞質是還原性很強的環境，大部分內源蛋白質都處于還原狀態。如果你向裂解緩沖液中加入還原劑，如0.1?
I rmnolZL的 D T T
，你通常可以使蛋白質保持在還原狀態，防止其在上述的再折疊的早期步驟中形成不想要的或不正確的二硫鍵。然而，只要你重折疊目標蛋白質，如果其能夠形成二硫鍵，你就必須在某些階段允許蛋白質的再氧化以形成二硫鍵。含有半胱氨酸
，但一般不含二硫鍵的蛋白質中, 其半胱氨酸未處于形成二硫鍵所需的精確的幾何構型中 [見 A nthony等
(2002)]。因此，雖然經常會存在大量可能的錯誤的二硫鍵，但其并不會輕易形成。最好的策略是在氧化還原緩沖液(redox buffer)
中進行蛋白質的重折疊。這種緩沖液(見下文)含有還原劑和氧化劑的混合物，可 以 允 許 二 硫 化 物 發 生 「洗牌」(shuffling)[見
G
ilbert(1994)]。二硫化物的「洗牌」是由二硫鍵反復形成和還原組成的。如果在錯誤折疊的蛋白質中形成了不正確的二硫鍵而且不能被還原，蛋白質就會被凍結在錯誤構象而不能達到天然狀態。如果這個二硫鍵得以還原，蛋白質就會繼續在半折疊中間狀態之間變化，直到形成正確結構。如果形成了正確的鍵,
它就可以穩定最終的天然蛋白質。即使偶爾被還原，蛋白質也會處于穩定狀態，而且通過再氧化又能形成正確的
鍵
。因為這個原因，僅在溶解緩沖液中而不在重折疊緩沖液中加入還原劑, 常常也可以取得成功。重折疊后，可以使蛋白質經歷緩慢的空氣氧化(在空氣中 暴 露
1?2 天），常常能獲 得正確的二硫鍵結構。關 于 更 多 的 再 氧 化 的 內 容 可 見 V allejo和
Rinas(2004)及Kirsten 和 Raines(2003)的文獻。
形成二硫鍵的一些經典方法如下所述。
(1) 空氣氧化 不 加 還 原 劑 暴 露 在 空 氣 中 數 天 。
(2) 氧化還原緩沖液 如 還 原 型 谷 胱 甘 肽 (G S H )/氧化性谷胱甘肽(G S S G )(10/1，3 m m o l / L G S H /0. 3 m m o l / L G S S G )。有多種氧化還原對(redox pair) 在使用，它們包括還原型谷胱甘肽(G S H ) 和氧化型半胱氨酸、二硫蘇糖醇 (D T T )和谷胱甘肽。為了取得最佳的二硫化物的再氧化效果，還原形式與氧化形式的摩爾比有時是不同的。
(3) 蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，P D I ) 該 酶 可 以 催 化 二 硫 化物 的 「洗 牌 」（Kersteen and Raines, 2003)。也 可 以 使 用 小 分 子 P D I 類 似 物（m i m i c s)(W o y c e c h o w s k y e t a l .，1999)。
在 瀏 覽 涉 及 重 折 疊 的 論 文 時 ，我 發 現 最 常 見 的 問 題 是 研 究 者 不 知 道 他 最 終 得 到 的 蛋白 質 是 否 進 行 了 正 確 的 折 疊 、是 否 是 單 分 散 性 的 (monodisperse) 以 及 是 否 具 有 完 整 的 生物 活 性 。常 見 的 方 法 是 酶 學 分 析 或 生 物 學 分 析 , 但 通 常 沒 有 任 何 標 準 。你 可 以 見 到 諸 如「由 于 終 產 物 具 有 活 性 ，這 顯 示 其 進 行 了 正 確 的 折 疊 而 且 具 有 完 整 的 活 性 」這 樣 的 描 述 。然 而 只 有 與 已 知 的 、具 有 完 整 活 性 的 標 準 品 進 行 比 較 后 才 能 評 估 終 產 物 具 有 多 少 活 性 。沒 有 比 較 ，你 只 能 知 道 其 有 活 性 ，但 無 法 確 定 活 性 蛋 白 質 的 百 分 比 是 1〇 〇 %、1〇 %、〇. 1 %還 是 0. 0 1 % 。如 果 可 能 的 話 , 對 重 折 疊 過 程 所 得 到 的 終 產 物 的 特 異 性 與 活 性 進 行 這 種 定 是 必 須 的 。
另
有 一 項 重 要 的 鑒 定 是 確 定 重 折 疊 蛋 白 質 的 大 小 。是 單 體 (單 分 散 性 )還 是 含 有 大 量可 溶
的 多 聚 體 [非 均 相 分 散 (heterodisperse)] 。 晶 體 學 家 通 常 使 用 動 態 光 散 射
(dynamiclight SCattering，D S L ) 來 確 定 純 化 的 、重 折 疊 或 未 重 折 疊 的 蛋 白 質 是 否
是 單 分 散 性 的 。另一 個 方 法 是 由 加 利 福 尼 亞 州 L a Jolla市 的 諾 華 研 究 基 金 會 基 因 組 研
究 所（G enomicsInstitute of the Novartis Research Foundation，G N F )的 M a
r k K n u t h 開 發 的 ，利 用 分 析 性分 子 篩 色 譜 技 術 (analytical size exclusion
chromatography，A N S E C )分 析 終 產 物 。我們
發 現 該 方 法 非 常 有 用 ，因 為 即 使 非 常
少 量 的 蛋 白 質 也 能 用 該 法 分 析 。通 常 ，我 們 用 12 m L的 S h o d e x K W -802. 5 柱
子 和 含 有 0. 25 m o l / L N a C l 的 緩 沖 液 ，以 0. 5 ? 1. 0 m L / m i n 的流 速
分 析 20? 5 0 ug 的 樣 品 ，同 時 監 測 280 r n n 和 215 n m 的 紫 外 線 吸 收 。 當 柱 子 用
合 適的 分 子 質 量 標 準 進 行 校 準 后 ，就 可 以 快 速 地 確 定 大 部 分 蛋 白 質 是 否 處 在 所 預 測 大
小 的 單體 形 成 的 單 一 的 峰 內 (單 分 散 性 , 好 情 況），或 者 大 部 分 蛋 白 質 是 否 更 早 地 被 洗 脫
，這 意 味著 多 聚 體 的 形 成 導 致 其 分 子 質 量 較 大 (非 均 相 分 散 ，糟 糕 的 情 況）。這 一 步 驟 的 分
析 是 一套 完 整 的 重 折 疊 測 試 實 驗 的 重 要 組 成 部 分 (見 下 文 ) 。
不 能 用 圓 二 色 譜 (circular dichroism，C D )或 免 疫 印 跡 ( Western Blot)分 析 確 定 活 性或 單 分 散 性 。大 量 的 實 例 表 明 ，有 許 多 蛋 白 質 與 天 然 的 標 準 品 具 有 非 常 相 近 的 或 相 同 的C D 譜 ，而 且 在 免 疫 印 跡 分 析 中 結 果 很 好 ，但 其 實 不 具 備 單 分 散 性 或 者 不 具 有 活 性 。