包涵體(inclusionbody)的純化

包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區，與胞質中其他成分有明顯區別。包涵體形成是比較復雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。包涵體的主要成分就是表達產物，其可占據集體蛋白的40%~95%,此外，還含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂類及糖類物質，所以分離包涵體后，還要采用適當的方法（如色譜法）進行重組蛋白質的純化。

（一）試劑配制

1、緩沖液A：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100mM NaCl。

2、緩沖液B：50mM Tris-HCl（pH8.0），1mM EDTA，100 mM NaCl，1%NP-40。

3、緩沖液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100（V/V），4M脲素。

4、緩沖液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，3% Triton X-100 。

5、緩沖液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA，100 mM NaCl，0.5%Triton X-100，2M 鹽酸胍。

6、緩沖液C：8M脲素，10mMβ-巰基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脫氧膽酸鈉。

（二）操作步驟

1. 用緩沖液A漂洗菌體細胞（10ml/g）， 離心6000g×15min,收集菌體細胞，重復此步驟，將菌體細胞再在緩沖液A中洗滌一次。

2. 將漂洗過的菌體細胞懸浮于緩沖液B中，超聲破碎，鏡檢，破碎率高于95%，離心1500g×30min,收集包涵體沉淀。

3. 將包涵體沉淀用緩沖液Ⅰ、緩沖液Ⅱ、緩沖液Ⅲ分別超聲洗滌一次，1500g 離心收集包涵體沉淀。

4. 包涵體的溶解：用含高濃度脲素的緩沖液室溫放置30min，然后離心1500g×30min，留上清。將溶解后的蛋白質適當稀釋，磁力攪拌，透析過夜。

5. 溶解后的包涵體蛋白可通過親和層析進一步純化。