動物組織RNA提取及純化

實驗概要

提取樣品組織中的RNA并消除DNA污染

實驗原理

Trizol裂解細胞使RNA釋放
beta巰基乙醇一直RNase活性
酚-氯仿抽提分離RNA
RNase-Free DNase消除DNA污染

主要試劑

Trizol
無水乙醇
氯仿（三氯甲烷）
異丙醇
RQ1 RNase-Free DNase（Promega，M6101）
液氮
RNase-Free water
醋酸鈉緩沖溶液（3M，pH5.2）

主要設備

離心機
研缽
熱塊
離心機

實驗材料

組織樣品

實驗步驟

組織中total RNA的提取

1. 取適量組織（約30mg）于研缽中加入液氮研磨，研碎后轉移至EP管中；

2. 向樣品中加入1mL Trizol，吹勻，放置5min；

3. 向上述EP管中加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min，4℃12000rpm離心15min；

4. 取上層水相500μL于新的EP管中（注意不要吸入沉淀），加入100μL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置3min，4℃12000rpm離心15min；

5. 取上層水相400μL于新的EP管中（注意不要吸入沉淀），加入400μL異丙醇，室溫放置10min，4℃12000rpm離心10min；

6. 棄上清，加入1mL 75%乙醇洗滌，輕彈混勻，4℃7500rpm離心5min；

7. 20μL RNase-Free Water溶解RNA；

8. 紫外測定RNA濃度，記錄A260/280，，瓊脂糖電泳鑒定RNA質量。

Total RNA中DNA的

DNA消化體系（100μL）

• RNA樣品：10mg（量不足可適量減少）

• RQ1 DNase 10* Reaction Buffer：10μL

• 補水至100μL

1. 如體系加好樣品，37℃孵育30min；

2. 向體系中加入100μl DEPC水；

3. 加入100μl氯仿，震蕩混勻，室溫放置10min；

4. 4℃13200rpm離心15min，吸取上層清夜150μl轉移至新的EP管中；

5. 加入0.1倍體積（15μl）NaAc Buffer及等體積（150μl）異丙醇，室溫沉降30min；

6. 4℃13200rpm離心15min，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀；

7. 4℃12000rpm離心5min，棄上清，開蓋放置晾干乙醇；

8. 20μl RNase-Free水溶解RNA；

9. 紫外測量濃度及A260/280，1.5%瓊脂糖電泳檢測RNA狀態。

注意事項

所用工具均經高溫滅菌
EP管、槍頭經DEPC處理
實驗地點盡量選擇空氣流動較少，實驗時帶口罩等。