功能基因cDNA序列的分析

（一） cDNA序列的測定
一．原理
DNA 序列測定技術，目前主要是根據Sanger 等提出的酶法和Maxam和Gilber 提出的化學降解法，這兩種方法的原理大致相同。這里主要介紹Sanger 的酶法——雙脫氧鏈終止法。
雙脫氧鏈終止法是Sanger 等人于1977 年建立起來的。它是利用了2'，3'-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）可以特異地終止DNA 鏈延長這一特點進行的。在DNA 聚合酶的作用下，ddNTP 的5'三磷酸基團可以與正在合成的DNA 鏈中的3'羥基形成磷酸二酯健，當ddNTP摻入到正在合成的DNA鏈以后，由于3’端是脫氧，不能再進行鏈延長，由此即可進行DNA分析。

序列分析的原料包括：待測序的DNA 膜板（或cDNA 模板）和一小段與膜板互補的DNA引物。將膜板與引物退火后分成4 個試管進行反應。每個試管中一種ddNTP（如ddATP）與其對應的dNTP(如dATP)按適當的比例混合，再加上其他三種dNTP(如 dCTP,dGTP,dTTP)所用 4種dNTP 中有一種必需是同位素標記的，通常是a32P-dATP 或a32S- dATP，如此分成AGCT 4 個反應管，在聚合酶的作用下，正常的聚合作用即從引物處開始，若摻入的是ddNTP（如ddATP），鏈延長即停止，若摻入的是dNTP（如dATP），鏈繼續延長，直至摻入另一個ddATP。這樣即可得一序列標記的DNA 鏈，其長度依賴于特定的ddNTP 相對于引物末端的位置。將4個反應管加到聚丙烯酰胺凝膠上電泳，標記片斷按大小分離，放射自顯影后即可按譜型讀出DNA序列。
但雙脫氧鏈終止法存在操作繁瑣，效率低，速度慢等缺陷，特別是結果判讀的讀片過程一項既花時間又乏味的工作。隨著科學技術的發展，操作簡便、結果清晰，易于解讀的自動測序技術于80 年代末發展并成熟起來，并得到了廣泛的應用。

DNA 自動測序的最基本原理與雙脫氧鏈終止法一樣，也是通過4 個酶學反應利用ddNTPs產生一系列一端固定，另一端終止所有不同的A，T，G，C堿基位點的DNA片斷，能夠進行自動測序的關鍵是采用熒光素標記代替了放射性同位素標記顯示高壓電泳分離結果。根據所用的熒光素種類不同可將目前所用的自動測序方法可大致分為兩類。
⑴ 使用4 種熒光素標記的自動測序方法 所用的4 種熒光發色基團在激光的激發下可以產生不同波長的熒光。用4種熒光素分別標記4 種雙脫氧核苷三磷酸終止的DNA片斷，這可形象比喻為賦予這4 組DNA 片斷以不同的顏色。使用4 種熒光素標記的DNA 片斷在電泳時將4組反應混合物加入同一樣品孔中進行電泳。自動檢測儀在膠的下端有一固定的檢測窗口，一束激光與穿過這里的DNA 片斷相遇，DNA 上的熒光發色基團受激發發出特定波長的熒光，熒光又被高靈敏度的光電管或二極管光電檢測器轉換成電信號輸入電子計算機加以貯存，4 種不同波長的熒光由安放在光電檢測器前的旋轉濾光片加以區分。這樣根據DNA 片斷通過檢測窗口的時間和顏色等原始信息經計算機處理后就可給出所測的DNA 序列。

⑵ 使用單熒光素標記的自動測序方法 這種自動測序方法更加類似雙脫氧鏈終止法。它使用一種熒光素標記所有的DNA片斷，電泳時與雙脫氧鏈終止法一樣將4 種反應產物加在4 個樣品孔中進行電泳分離。在膠的底部有一個由激光光源和光電檢測器組成的檢測系統，每個樣品道后都有一個檢測器。當DNA片斷遷移至檢測區并與激光相遇時，熒光標記物即被激發發出熒光。熒光被光電檢測器接受并轉換成電訊號送至計算機貯存。由于按特定的次序加樣（如A，C，G，T），所以第一個檢測器檢測到的信號代表A，第二個檢測器檢測的信號代表C，以此類推。電泳結束后計算機便收集到一套完整的信號，通過計算機處理后，就得到所測DNA的序列。
二． 序列測定的方法
⑴ 克隆的基因委托TaKaRa 生物工程（大連）有限公司用ABI PRISMTM 377 全自動熒光測序儀完成序列測定。
⑵ 計算目的基因片斷的長度，推測其編碼氨基酸數量。

（二） cDNA序列的同源性比較
克隆的cDNA是否為新基因？它與其他已發現的基因序列有何異同？這一切可通過相應的軟件（如Blast、FastA、PIMA、MAP等）對網上多個DNA序列數據庫（Gene Bank、EMBL和DDBJ等）中已登陸的序列進行搜索、比較，了解序列間的相似程度，以判斷該片斷是新基因還是某基因家族的成員。有些基因的核苷酸順序與其他基因并無十分高的同源性，僅通過核苷酸順序的同源性比較無法得到十分有參考價值的信息，然而其編碼的蛋白質的氨基酸順序卻可能與其他某些多肽高度同源，從而提示該蛋白的可能功能。因此，從某種程度上說，氨基酸序列的同源性比較有時比核苷酸序列的同源性比較更有意義。
方 法：

最高的基因，確定所克隆的基因是否為目的基因。
③ 確定了為目的基因后，再次登陸NCBI網站主頁，在Search的復選框中選擇Nucleotide，在for的選框中鍵入目的的基因，如β- actine，然后按Go鍵搜索已發表的不同物種的β- actine基因。
④ 經搜索后，網頁上會顯示一系列物種編碼。單擊某物種編碼查找該物種的基因。將其中若干種物種的β- actine基因的核苷酸序列及氨基酸序列下載下來。
⑤ 根據已知的核苷酸序列，應用計算機軟件推出相應的氨基酸序列，并利用相關的軟件對所下載的物種的基因的核苷酸序列及氨基酸序列進行多重比較，得出不同物種同一基因的同源性。
⑥ 另外，以便后續工作的進行，登陸NCBI網站查找目的基因已登陸的基因組DNA序列，將所獲得的cDNA序列跟已登陸的基因組DNA序列進行比較，弄清目的基因內含子、外顯子的位置。