關于光片顯微鏡，通過前面第一，第二期的介紹，相信大家已經有了較為全面的了解。在本期中，我們將介紹另外幾種光片顯微技術，它們和第二期最后介紹的晶格光片顯微鏡一樣，都是對傳統光片顯微技術的改進，以滿足更高的成像要求。最后，我們將為大家總結如何挑選適合光片顯微鏡的科學相機。
雙向倒置平面照明顯微鏡（Dual-view inverted SPIM，diSPIM）是由NIH的Hari Shrof 實驗室和 Applied Scientific Instrumentation (ASI) 公司合作開發的。它本質上是L-SPIM，通過柱形透鏡來產生光片，不同的是它是倒置的，兩個相互垂直，規格相同的物鏡位于樣品上方，浸入介質中，輪流進行照明和成像，可以達到各個方向上相同的分辨率（330nm）。iSPIM (inverted SPIM)與之原理相同，只是采用單向照明與成像，因此和其他傳統光片系統一樣，軸向分辨率要比橫向分辨率差2-3倍。
圖1 diSPIM：兩個物鏡輪流進行照明和成像
(d)iSPIM可以安裝在任何的倒置顯微鏡上。采集速度可以達到200fps，信噪比和轉盤共聚焦顯微鏡差不多，特別適用于活體3D成像。與大多數其它光片顯微鏡需要將樣品嵌入凝膠中并懸浮在物鏡之間相比， (d)iSPIM的樣品制備相對比較簡單，而且方便固定。通過更換介質，可以在長時間內對活體樣品成像。
傳統的光片顯微鏡中，成像和照明物鏡是相互垂直的，成像物鏡需要和樣品保持一定的距離。為防止兩個物鏡發生碰撞，需使用工作距離較長的低倍物鏡，不適合NA值高的高倍物鏡。這就為檢測細胞或亞細胞水平結構帶來了困難。使用傳統的光片顯微鏡進行細胞或亞細胞水平成像，往往只能用多角度成像，再進行反卷積后處理，數據量龐大，費時費力。
為了解決這個問題，傾斜平面照明顯微鏡(Oblique Single Plane Illumination Microscopy，oSPIM）應運而生。oSPIM 將照明物鏡置于樣品下方，以30°傾斜角生成光片。高NA值的成像物鏡位于樣品上方，與照明物鏡成60°角，垂直于光片（圖2）。這樣就可以避免物鏡發生碰撞，為使用高倍物鏡創造了條件。另一方面，可以放置35mm以上的培養皿，為細胞和組織培養樣品提供了理想的平臺。
oSPIM 將光片顯微鏡低光漂白和光損傷的優勢與高分辨率高放大倍率結合起來，可用于長時間細胞和亞細胞水平成像。同時，照明物鏡也可用于常規熒光成像，如寬場、共聚焦或TIRF。這樣一來，oSPIM系統可以將高分辨率熒光顯微鏡與高分辨率光片顯微鏡結合在一起，提高了系統的靈活性。
圖2 傾斜平面照明顯微鏡 （oSPIM）
和 iSPIM 一樣，oSPIM也不能達到各個方向上的分辨率一致。這時只要在樣品下方使用第二個照明物鏡，通過兩個物鏡依次生成光片（doSPIM），就可以在所有3個維度均獲得良好的分辨率（每個維度低于300nm，但由于照明和成像物鏡非正交，因此不完全一致）。不過，由于照明物鏡傾斜，doSPIM 無法像 oSPIM 那樣作為傳統熒光顯微鏡使用。
另外還有一種采用傾斜光片方法的光片顯微鏡——TILT Light-sheet microscopy。 它是由北卡羅來納大學的 Paul Maddox 研究組率先開發的，現在已經由Mizar公司制造和銷售。TILT 不需要照明物鏡，而是利用一種稱為橫向干涉傾斜激勵（LITE）的技術，將校準后的激發光束依次通過光罩（Photomask）和柱形透鏡，聚焦成近似矩形棱鏡形狀的光束。然后將光片傾斜，通過這種方式，照明光片可以在非常接近成像物鏡處生成（圖3，下）使TILT光片系統也能夠使用高倍物鏡（60x，1.49）成像。
圖3 傳統光片照明（上）vs TILT（下）
TILT 使用的樣品可以固定在玻片上，不需要特殊制備的樣品，也不需要進行復雜的反卷積后處理。它可以安裝在大多數正置或倒置顯微鏡上，還可以與微分干涉（DIC）或其他顯微技術相結合使用，因此和 oSPIM 一樣具有很高的靈活性。
在第一期中我們說過光片越薄，光學切片能力越好，軸向分辨率也越高。但是，光片的厚度和寬度是相互制約的，因此很難同時滿足高軸向分辨率和大視野兩個需求。為了解決這一難題，高亮等人開發了一種新的光片技術——拼接光片顯微鏡（Tiling-light sheet Microscopy）。通過高NA照明物鏡形成薄而窄的照明光片，然后使用空間光調制器（SLM），將照明光片在整個成像視野中快速移動，將每一個位置獲得的圖像拼合起來，就可以得到整個成像視野的完整圖像，達到“拼接”多片光片的效果（圖4）——增加有效視野的同時又不損失軸向分辨率。
圖4 拼接光片（Tiling-light sheet）(L Gao, 2015)
Tiling-light sheet 可根據樣品及具體成像要求，對光片的厚度和拼接數量進行靈活的調整。再結合貝塞爾光束，可以快速地對大樣品進行高分辨率3D成像。
光片顯微鏡通常使用低倍物鏡（如20x）以提供足夠大的工作距離和更大的視野。為了在低倍鏡下達到最高分辨率，建議使用像元較小的相機，如 4.25 μm 像元的 Teledyne Photometrics IRIS 系列等。
但是，小像元相機靈敏度相對較低，而大像元相機靈敏度更高，可以縮短曝光時間，提高成像速度。因此，相機選擇要根據具體的應用和不同的光片技術綜合考慮。例如，我們在前文中提到的 diSPIM，oSPIM 和 TILT 等通常使用高倍物鏡（40x，60x等），我們建議使用像元更大的相機，如背照式 sCMOS Prime BSI（6.5 μm 像元），Prime 95B（11 μm 像元）。它們不僅能夠提供與高倍物鏡相匹配的分辨率，靈敏度也大大提升。允許減少曝光時間或降低激發光強度，進一步降低光漂白和光毒性，從而可以在更長的時間尺度上對活細胞進行成像。
圖5 Prime 95B 在 TILT 光片顯微鏡下拍攝的表達 LifeAct-mCherry 的裂變酵母菌（150x , 1.49NA）。Prime 95B 滿阱容量高達80000e-，讀出噪聲低至1.6e-，具有真實 16bit 動態范圍，提高成像對比度。(From Paul Maddox)
Iris 15，Prime 95B 都具有對角線25mm的大視野，對大樣品進行成像時可以大大減少后期工作量（圖6）；對小樣品來說，大視野相機也可以設計為多通道同步成像。因此在滿足要求的情況下，選擇大視野的相機總是有好處的。
圖6 Iris 15 拍攝的透明斑馬魚圖像（8mmx 2mm）(FromJan Huisken's Lab)
除此之外，光片顯微鏡常常會用紅外和近紅外激發光對大樣品進行深部成像，因此相機在這個近紅外波段的量子效率也很重要。這時，背照式相機就有很大優勢。
商業化光片系統通常價格昂貴，有時也不一定能夠滿足特定需求，怎么辦呢？德國馬克斯普朗克分子細胞生物學和遺傳學研究所的Peter Pitrone 和 Johannes Schindelin 以及美國威斯康星大學麥迪遜分校光學和計算儀器實驗室的科學家們聯合創建了OpenSPIM平臺。 顧名思義，它是開源的，主要針對的是那些想嘗試自己搭建光片顯微成像系統的用戶。在OpenSPIM主頁（http://openspim.org），您可以學習有關光片顯微鏡的基礎知識，訪問自搭建系統的零件清單，閱讀詳細的動畫版手冊，并通過在線社區與其他用戶進行溝通。OpenSPIM平臺具有高度的靈活性，即便沒有深入的光學知識，也可以通過學習自己建立起一個滿足特定需求的光片系統。Teledyne Photometrics 的 IRIS 系列，Prime BSI，Prime 95B sCMOS 相機能夠滿足多種光片系統的要求，是您自搭建光片系統的最佳選擇。
References
Abhishek, K., Wu, Y., Christensen, R., Chandris, P., Gandler, W., McCreedy, E., Bokinsky, A., Colon-Ramos, D. A., Bao, Z., McAuliffe, M., Rondeau, G. & Shroff, H. (2014) Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat Protoc. Nov; 9(11): 2555-2573; doi: 10.1038/nprot.2014.172
Fadero, T. C., Gerbich, T. M., Rana, K., Suzuki, A., DiSalvo, M, Schaefer, K. N., Heppert, J. K., Boothby, T. C., Goldstein, B., Peifer, M., Allbritton, N. L., Gladfelter, A. S., Maddox, A. S. & Maddox, P. S. (2017) LITE microscopy: a technique for high numerical aperture, low photobleaching fluorescence imaging. Preprint. https://doi.org/10.1101/181644
Liang Gao, Tiling light sheet selective plane illumination microscopy using discontinuous light sheets. bioRxiv (2018) 378232.
Peter G Pitrone, Johannes Schindelin, Luke Stuyvenberg, Stephan Preibisch, Michael Weber,Kevin W Eliceiri, Jan Huisken & Pavel Tomancak. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods 10, 598–599 (2013) doi:10.1038/nmeth.2507
國家市場監督管理總局（國家標準化管理委員會）廢止《顯微鏡鏡筒滑塊和鏡筒槽的連接尺寸》等31項推薦性國家標準，現予以公告。國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會2025年12月31日附件下載關于廢止《......
西南林業大學教學科研重大設備更新項目發布，預計2026年2月采購，預算金額15467萬元。該項目旨在構建“三平臺一網絡”體系：林業工程材料檢測平臺、林學生態監測平臺、智能分析共享平臺、區域服務網絡通過......
近日，海關總署陸續發布2025年顯微鏡三批次集中采購項目的中標結果，浩視、京百卓顯、Nexcope、奧林巴斯四家企業中標。2025年，海關總署集采的顯微鏡項目共分三批次、三個標項開展招標工作。此次中標......
RESEARCHPROGRESS2025年11月29日，北京腦科學與類腦研究所吳江來實驗室在NatureCommunications上發表題為High-throughputtwo-photonvolu......
公告內容為便于供應商及時了解政府采購信息，根據《財政部關于開展政府采購意向公開工作的通知》（財庫〔2020〕10號）等有關規定，現將本單位2025年10月至2025年11月采購意向公開如下：序號采購項......
圖tr-FPs熒光壽命調控機制及其在多重成像中的應用在國家自然科學基金項目（批準號：22494700、22494702、22477102、82273257、32450793、22222410、2237......
......
——徠卡中高端顯微鏡本土化交付慶典訪談2025年8月29日，上海浦東金橋工業區的徠卡金橋工廠洋溢著熱烈的氛圍。徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司（以下簡稱“徠卡”）隆重舉辦“創升中國顯微新境”——DM4......
●蔡司蘇州研發制造基地開業一周年，持續推動本土創新和智能制造，現已成為蔡司全球顯微鏡業務的戰略樞紐。● 三款高端顯微鏡產品——蔡司激光共聚焦顯微鏡LSM910，蔡司場發射掃描電子顯微鏡Sig......
2025年8月29日，徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司（以下簡稱“徠卡”）在上海金橋工廠舉行中高端顯微鏡本土化交付慶典，首批國產DM4/6/i8顯微鏡正式下線。近百位專家、學者及政府領導齊聚一堂，共同......