一、液體介質
垂直柱狀蔗糖密度梯度等電聚焦是原瑞典 LKB 公司早期用于制備和分析目的的等電聚焦方法。載體兩性電解質在蔗糖密度梯度柱中形成 pH 梯度，樣品根據它們的等電點進行分離，使用這種方法所需的時間較長。
有些也使用液體介質進行制備等電聚焦。但它是水平圓柱狀方式，分成 20 個腔。腔間用單絲聚酯篩做成的膜隔開，據稱使用這種方法所需的分離時間只要 4 小時左右，上樣量可達 4 g。
二、凝膠介質
使用聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質進行制備等電聚焦可以得到很好的分辨率，但是凝膠孔徑小，分離后的洗脫比較困難，所以在凝膠介質中的制備等電聚焦大都采用專門純化后的 Sephadex，LKB 公司將此稱為 “Ultrodex”（顆粒凝膠 )。它帶電少，機械性能好，電滲效應弱，清洗后可重復使用。一般水平電泳儀均可使用凝膠介質進行制備等電聚焦。
三、方法
1. 電極液，固定，染色和脫色液的配置同 “載體兩性兩解質 pH 梯度等電聚焦”。
2. 95 ml 去鹽的樣品液加 5 ml 載體兩性電解質。
3. 將 4 g Ultrodex 慢慢地加入上述的溶液中，邊加邊攪拌，溶解后稱重。
4. 將凝膠和樣品溶液倒入制備盤中，輕敲，使凝膠均勻分布在盤中，見圖 12.1。稱燒杯和剩余膠液的重量。
5. 打開膠盤上方 70 cm 處的小風扇，吹膠，使水分蒸發。見圖 12.2，吹膠一段時間后，稱重。根據 Ultrodex 瓶上標明的蒸發限， 可推算出應蒸發掉的水的重量。室溫下，一般要吹 3~4 小時，方可蒸發掉合適的水量。膠中的含水量十分重要，若過高，聚焦后蛋白區帶易沉積在膠床底部。紙印時，濾紙因未黏上蛋白而無法顯色，且凝膠中的蛋白帶成波浪狀。含水量過低，則膠床開裂。
為了縮短電泳時間和提高分辨率，膠液中可以先不要加樣品，吹膠后，將等電點附近的凝膠挖出和樣品混在一起，再加在原處，見圖 12.3。
6. 一定量的水蒸發后，關掉小風扇。在水平電泳槽的冷卻板上加一些 0.1% Triton X-100。小心將膠盤移至冷卻板上，排除氣泡，使膠盤和冷卻板很好地接觸，以利熱傳導。將分別浸濕陰、陽兩極電極液的電極條分別置于陰、陽兩極。連接電極，接通電源，開始電泳。電泳可使用恒功率方式，電壓緩慢上升，電流不斷下降，一般應電泳過夜。
7. 電泳結束后，用一張干凈濾紙從膠盤一端蓋滿膠面且不留氣泡，約 1 分鐘后小心將濾紙揭下。與凝膠接觸的面朝上，放于玻璃板上用冷風吹干，將濾紙按需要染色，這就是所謂的 “紙印” 技術。可以紙印幾張濾紙，以不同方法染色，以確認感興趣蛋白的位置。
8. 如需要，用表面電極測定凝膠中 pH 梯度。
9. 將印有蛋白條帶的濾紙，置于膠盤下，在燈箱上觀察。根據濾紙上蛋白條帶的位置，用不銹鋼勺將所需條帶逐一取出，各自放入相應的洗脫小柱中。取膠時動作應迅速，并應取完全，以保證產率。
10. 在洗脫小柱中加入適量的洗脫緩沖液，緩沖液體積過小，洗脫不充分，影響產率。洗脫液體積過大會給濃縮帶來困難。洗脫小柱的底部有一篩孔膜，純化的蛋白質將隨緩沖液流下，膠則留在膜上。
11. 載體兩性電解質無毒，分子質量約為 1000 Da 左右。在很多情況下可起到穩定蛋白質的作用，且為可逆性結合，所以可用透析、超濾、硫酸銨沉淀，層析等方法去除樣品溶液中的載體兩性電解質。 展開 | 