實驗材料 修飾胰蛋白酶
試劑、試劑盒 消化緩沖液萃取液清洗液脫色液
儀器、耗材 多通道移液槍Eppendorf Repeater 分液器Combitips 分液管
實驗步驟
3.1 膠內蛋白的水解和多肽的提取（一天的實驗方案)
對于從 SDS-PAGE，2D-PAGE，BN-PAGE 電泳（經考馬斯亮藍 G-250 染色）得到的蛋白質 [11]，這個方案是可行、有效的。它不需要使用自動酶切儀（digestion robot) 。使用多通道移液槍和微孔板格式， 一天可以處理 96 個樣品。標準的方法不需要對蛋白質進行還原和烷基化反應。這兩個反應步驟比較花時間，但是對大部分的蛋白質鑒定沒有影響，即使使用 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 得到的樣品。但根據我們的實驗，這兩個反應步驟似乎是角蛋白污染的一個重要來源。然而，在富含半胱氨 酸的情況下，蛋白質的還原和烷基化可能會增加蛋白質的覆蓋率（見注釋 1)。多通道的移液槍用于去除不同的液體，Eppendorf 分液器用來分配溶液。蛋白質的還原和 烷基化均須在 37°C 與攪拌情況下進行。
( 1 ) 將凝膠切塊（直徑 1.5 mm) 放入管子中。非液體凝膠可以在 4°C 存放數周，也可以在 -20°C 存放幾個月。用油漆膠帶進行密封。
( 2 ) 脫色：用 50 μl 脫色液處理 2 X 30 min。
( 3 ) 清洗：用 50 μl 洗滌液清洗 15 min。
( 4 ) 收縮：用 50 μl 收縮液處理 15 min。
( 5 ) 清洗：用 50 μl 洗滌液清洗 15 min。
( 6 ) 收縮：用 50 μl 收縮液處理 15 min。
( 7 ) 收縮：用 50 μl 收縮液處理 15 min。
( 8 ) 將膠條夾置于冰上 10 min 后，加入 5 μl 胰蛋白酶（20 ng/μl 酶解緩沖液），靜置 10 min。然后將膠條夾置于熱混合器上 4 h。經胰蛋白酶酶解 2 h 后添加 5 μl 酶解緩沖液，以彌補液體的揮發。
( 9 ) 提取 1 : 添加 15 μl 提取液，等待 15 min。轉移提取物。
( 10 ) 提取 2 : 加 15 μl 乙腈，等待 15 min。轉移提取物。
( 11 ) 干燥：在室溫下蒸發過夜或使用 Spped VAC 干燥 30 min ( 見注釋 2) 。
可選步驟：還原和烷基化
( 1 ) 用 10 mmol/L ( 1.5 mg/ml) DTT 和 55 mmol/L ( 10 mg/ml) 碘乙酰胺（IAA ) ( 溶在 50 mmol/L NH4HCO3) 處理可以進行還原和烷基化。
( 2 ) 在 20.3.1 中步驟 4 完成后，添加 25 μl 的 10 mmol/L DTT。在 56°C 下反應 1 h。
( 3 ) 取出液體，加入 25 μl 的 55 mmol/L IAA。讓反應繼續進行，在室溫下暗中反應 45 min。移去液體，并轉到 20.3.1 中步驟 5。
3.2 高效液相色譜和 ESI 設置
( 1 ) nanoLC 存在的主要問題是失準或出現壞的管切（tube cutting) 。這會導致時間延遲和稀釋液體。如果在 75 μm 色譜柱和質譜儀之間存在死體積，會出現拖尾效應。如果在 75 μm 色譜柱之前存在死體積，則隨著保留時間（retention time) 增 加，肽段會洗脫下來，但不會有嚴重的色譜退化。
( 2 ) 連接前，應用放大鏡檢查管路兩端以確保它們是干凈的而且垂直切割的。
( 3 ) 圖 20-1 給出了配備有 RP 捕獲柱和納米柱的 nanoLC 示意圖，將在下面的步驟描述。液體接頭是用來提供電壓。這種方法可以延長噴針的壽命（見注釋 3)。
( 4 ) 從自動進樣器到捕獲柱，使用直徑為 50 μm 的管子；從捕獲柱到開關閥，使用直徑 50 μm 的管子；從開關閥到分析柱，使用直徑 20 μm 的管子；從分析柱到噴霧針，使用直徑 20 μm 的管子。
( 5 ) 用 TEFZEL 密封墊，TEFZEL 套圈和 PEEK 螺母將毛細管連接到閥門端 口 ( 標準端口 1/16 英寸，1 英寸= 2. 54 cm) 。這些配件比不銹鋼密封墊圈和螺母壓力較低，但在緊固毛細管路時不容易破壞毛細管路。
( 6 ) LC Packings 公司的 nanoLC 柱配備了一個直徑為 20 μm 的出口管。該管切成 3 cm ( 9 nl) 。使用一個聚四氟乙烯接頭（特氟隆管，直徑 300 μm ) 將管連接到納米級噴霧針，這時縮短至 3 cm。這種連接在噴霧針堵塞時不能忍受壓力。這個缺點也可能是優點：聚四氟乙烯接頭泄漏意味著針尖堵塞，通常跟不規則的噴霧有關。
( 7 ) 使用液體接頭（Microtee 連接器）提供電壓。根據我們的經驗，這是較強的配置。Microtee 放置在 75 μm 色譜柱前面，電極為鉑絲（見注釋 4) 。帶有液體接頭的噴霧針是不加涂層的（外徑 360 μm，內徑 20 μm，針頭內徑 10 μm ) 。
( 8 ) 如果泵裝置采用的分流器只能提供一個 nl/min 的流速而沒有流速檢測器（舊版本的 LC Packings 儀器），則流速必須用連接到 75 μm 色譜柱的 25 μl 注射器進行檢查。LC Packings 系統是 nanoLC，使用了 1: 1000 的分流。泵的流速在 150~250 μl/min 的 75 μm 色譜柱上應為 150~200 μl/min ( 見注釋5) 。
3.3 HPLC 分離
( 1 ) 表 20-1 給出一個典型的 250 nl/min 速度梯度。該流程還可以優化：如在開始和再生過程中，流速可以為 300 nl/min 以減少延誤；在肽段檢測時，流速可以設置為 200 nl/min。這方面的發展在峰值駐留系統（peak packing system ) 中進行了優化 [12] 。
( 2 ) 在第 1 部分，從 0~3 min，閥門在位置 1一2 ( 見表 20-1 和圖 20-1)。自動進樣器注入 5 μl 的樣品，樣品以 7 μl/min 的流速加載和捕獲于反相前置柱。在第 2 部分的開始，閥門轉換到位置 10—1，將捕獲柱和柱連接起來。然后樣品使用反相過柱方式以 250 nl/min 的 nanoHPLC 梯度洗脫。第 3 部分是清潔柱子的再生步驟。
( 3 ) 梯度取決于柱子及其配件。應根據對照如牛血清白蛋白（BSA ) 的胰蛋白酶酶解產物（100~300 fmol 的注射量）進行調整。
( 4 ) 酶解產物溶解在 10~15 μl 的含有 TFA 的樣品溶液中。TFA 在裝載溶劑中作為離子配對試劑，因為與甲酸比較，它可以更好地捕獲前置柱上的肽段。另外，甲酸作為高效液相色譜法溶劑 A 和 B 的添加劑，因為 TFA 強烈抑制電離。
( 5 ) 在這些條件下，一個完整的流程需要 45~50 min。圖 20-2 是一個色譜圖的例子，該圖來自于一個復雜的多肽混合物。在 11~35 min 洗脫肽段。MS 基峰圖類似于紫外圖譜，借此可以檢驗分離的效果和質量。MS/MS 掃描的 TIC 顯示了在多肽分離的范圍內具有很高的信噪比。
3.4 質譜儀設置
( 1 ) 利用 nanoLC，只需 10~40 s 就能將多肽樣品洗脫下來。因此，儀器在不到 10s 內就能完成一個循環（在 MS 模式和相關 MS/MS 掃描的一個核查掃描，攝入 survey scan) 。這里所描述的一些步驟，雖然是專門針對帶有軟件 Xcalibur 1.3 的 LCQIT，但主要原理對于所有的 MS/MS 儀器來說都是相同的：MS/MS 是數據依賴性，即在 MS 模式中若檢測到了一個數據峰，MS/MS 就會自動采集數據。
( 2 ) Xcalibur —個高效的采集方法是 “ Nth”法 。這種方法是一個連續的 3 次掃描：① 全質譜掃描（m/z 350~1900 )；② 變焦掃描（ZoomScan) ( 掃描兩個主要的具有較高分辨率的離子）；③ 這兩個離子的 MS/MS ( 見注釋 6) 。
( 3 ) 液體接頭處的電離電壓設置為 1.2~1.6 kV。如果需要增加超過 160 kV 的電壓，一般表明噴針或緩沖液出現了問題。在這種情況下，首先更換納流噴霧針，并用 1.3 kV 對其進行測試。如果問題仍然存在，則變換緩沖液 （ 見注釋 7) 。
( 4 ) LCQ 儀器的裂解參數為 0.22，活化時間為 50 ms，碰撞能量為 35%~45%。Qz 從 0.25 降低至 0.22，意味著在 MS/MS 掃描中可以檢測更小質量的肽段（見注釋 8)。
( 5 ) 動態排除法可以用來防止對同一離子進行連續的 MS/MS 分析（見注釋 9) 。
( 6 ) 排除列表是用來避免噪聲分析。一些聚硅氧烷離子通常會出現在質量為 371 Th、445 Th 和 462 Th [13] 。
( 7 ) 采用 LCQIT、“ Nth” 法和 50 min 的采集時間，得到的原始文件大小大約是 12 Mo。
3.5 數據處理和解析
( 1 ) 數據分析是一個具有 3 個步驟的過程。
a. 第一步，從原始文件中提取 MS/MS 譜圖并進行篩選。
b. 第二步，與從挑選的序列數據庫中獲得理論 MS/MS 譜圖進行比較。對于一個實驗 MS/MS 圖譜，父本離子的質量是用來從數據庫中提取 “同量異位的（ isobaric)” 的肽段。如果使用特定的酶如胰蛋白酶，只有那些具有特異性而能產生同量異位的肽段，才可以從數據庫中提取出來。然后該軟件根據裂解規則和 Roepstarff 和 Fohlman 提出的注釋將 MS/MS 理論圖譜中的肽段序列進行轉換 [14] 。
c. 最后一步，是進行實驗圖譜與從序列數據庫中獲取的不同系列圖譜之間的相關性分值的計算。這里的數據分析采用了 BIOWORKS 軟件（以前為 Sequest) 。在這個軟件中，相關性分值稱為 XC。
( 2 ) 與埃德曼（Edman) 測序相反，鑒定的序列不是基于連續氨基酸的實際檢測。如果數據庫中沒有完全一致的序列用于查詢，則不可能進行肽段識別。而且，肽段識別是基于與已知序列的相關性進行的。與其他的算法類似，BIOWORKS 采用了得分制從而給出每個 MS/MS 譜中最可能的肽段 [ 15，16] 。這意味著一個錯誤的肽段序列也可能成為備選序列，這會導致錯誤的蛋白質鑒定。為了減少這個錯誤的發生，應當至少用兩個 MS/MS 譜圖去識別同一蛋白的兩個肽段。
( 3 ) —般用已經測序的模式物種的蛋白質數據庫來鑒定蛋白。對于其他物種，EST 重疊群數據庫也是合適的（見注釋 10)。在一些 FTP 站點可以獲得蛋白質數據庫和 EST 數據庫（見注釋 11)。
( 4 ) 數據庫可以使用一個數據庫的索引調整法進行預處理。此功能可以使查詢時間減少 10 倍。不幸的是，索引調整固定了裂解的特異性和授權的質量修飾。如果選擇索引調整數據庫，可設置蛋氨酸氧化（ + 16 ) 為一個可變修飾（即蛋氨酸可被認為是氧化的）（見注釋 12)。
( 5 ) MS/MS 譜圖是根據 TIC 的強度和時間范圍的時間間隔來提取的。如果在 20~40 min 范圍洗脫肽段，則使用這些數值作為時間范圍內的參數。必須按照正確 MS/MS 圖譜的最小 TIC 來設置 TIC 強度（LCQ 通常為 1X105~5X105) 。MS/MS 提取可以產生 50~200 MS/MS 圖譜。
( 6 ) 大規模樣品數據采集可以在批量模式下進行樣品處理。安裝有 BIOWORKS 的電腦（Pentium 4 處理器和 512 MB DDR SDRAM 內存）利用 SWISS-PROT 數據庫進行比較時，每個譜圖需要 1~2s。進行 nanoLC 分析得到結果需要 1~2 min。
( 7 ) 首先，使用 SWISSPROT 數據庫。該數據庫可以檢查角蛋白污染和胰蛋白酶肽段，庫中包含了注釋好的序列。
( 8 ) 其次，使用特定的植物數據庫。如果使用 EST 數據庫，軟件將會翻譯成蛋白質數據庫。設置翻譯碼（frame of translation) 為 6 個可能性（三個正向和三個反向翻譯碼)。
( 9 ) 不同樣品的對應結果都會存儲在樣品名稱目錄中。選擇 Multiconsensus result 可以獲取結果。
( 10 ) 根據 XC 的臨界值 1.4~1.7，2~2.5 和 2.5~3 ( 分別對應帶有1 個、2 個 和 3 個電荷的肽段）來篩選肽段鑒定。一些錯誤的肽標識也會保留在列表中。它們通常是一些嘈雜的光譜。這就解釋了只有兩個 MS/MS 光譜用于識別時為什么需要人工檢查的原因。
( 11 ) 刪除那些只有一個 MS/MS 圖譜鑒定出的蛋白質。如果蛋白質是用兩個 MS/MS 譜圖鑒定的，人工檢查一下實驗譜圖中強度最大的峰有沒有用于匹配。
( 12 ) 如果 “沒有酶” 選擇作為查詢參數以及胰蛋白酶用來酶解消化，檢查候選肽段是否真的是胰蛋白肽段。此檢查似乎是相關標準，應毫不含糊地驗證識別。
( 13 ) 表 20-2 是一個 BIOWORKS 簡要輸出的例子，是二維凝膠的蛋白點在膠內胰蛋白酶消化后進行 nanoLC- MS/MS 分析結果。nanoLC-MS/MS 運行過程中產生的數百個 MS/MS 譜圖，有足夠強度可用來提取和用于數據庫查詢的還不到 100 個。用于查詢的 EST 數據庫沒有索引，也沒有酶的特異性，蛋氨酸氧化被認為是可變的。采用 XC 閾值來過濾肽段鑒定（XC 幅度高達 1.5、2 和 3) 。通過篩選的 19 個 MS/MS 圖譜被確認為是胰蛋白肽段 （表 20-2)。沒有指定某種酶進行搜索時，已鑒定肽段 C 端的賴氨酸或精氨酸參加增加了匹配的可信度。電荷值是父本離子的電荷。大多數的胰蛋白肽段帶有兩個電荷。然而，三個單電荷離子可識別具有顯著 XC 值的肽段，并確認出雙電荷獲得離子的鑒定結果 （肽段 DTGLFGVYAVAK) 或識別新的肽段（ IDAVDASTVK 和VTEEDVIR) 。每個 MS/MS 譜圖與幾個肽段相關，但只有第一命中率的列在表 20-2。△Cn 是第一與第二命中率之間相關性的差值（XC1- XC2）/XC1，該值應大于 0.1。離子的數值是 MS/MS 圖譜中實驗離子的數目，與從肽序列預測的理論離子相匹配。例如，18/22 表明，在計算出的 22 個離子中，MS/MS 譜含有 18 個。在肽段序列，M * 對應蛋氨酸亞砜；蛋氨酸氧化后（+16 ) 的部分序列為 ILVANTAMDTDK 和 VVPEMVMAK。