利用大引物PCR在同一試管中進行高效快速定點誘變實驗

擴增緩沖液含有四種 dNTP 的混合溶液熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠正向和反向內引物誘變引物模板 DNA

帶屏障裝置的自動移液器用吸頭微型離心機用離心管可調式移液器

材料

緩沖液和溶液

貯存液，緩沖液和試劑的成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。

10x 擴增緩沖液

含有四種 dNTP 的混合溶液，每一種 dNTF 的濃度為 2.5 mmol/L

酶和緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶 [Hot-Tub DNA 聚合酶（Amersham) 或同類產品]
大多數 DNA 聚合酶保存在含 50% 甘油的貯存液中。這種溶液非常粘稠，很難準確取量。最簡單的方法是在微型離心機上將含酶的離心管在 4°C 以最大轉速離心 10s, 然后用一個可調式移液器取出所需數量的酶。用一個帶屏障裝置的自動移液器裝配 PCR 反應成分。

凝膠

1% 的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠（含 0.5ug/ml 溴化乙錠）。

核酸和核苷酸

引物
將正向和反向內引物以 100umol/L(100pmole/ul) 的濃度溶解在水中。
將誘變引物以 10mmol/L(10pmole/ul) 濃度溶解在水中。

模板 DNA

通過溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心（第 1 章方案 10 或 11) 或用 Qiagen 樹脂柱層析純化超螺旋雙鏈質粒 DNA(第 1 章方案 9)。將模板 DNA 以 0.1ug/ml 的濃度溶解在 TE(pH8.0) 溶液中。

專用設備

帶屏障裝置的自動移液器用吸頭

微型離心機用離心管（擴增用 0.5 ml 薄壁管）

可調式移液器

可按所需擴增條件設定程序的熱循環儀
如果熱循環儀不配備加熱蓋裝置，使用礦物油或石蠟油以防止 PCR 過程中反應混合物液體揮發。

其他試劑

本方案步驟 6 所需的試劑列在第 1 章方案 17 或 19 中。

方法

1. 使用 0.5 ml 微量離心管或擴增反應管（置冰上），混合下列第一輪擴增反應需要的

試劑：

10X 擴增緩沖液 10ul
質粒 DNA 模板 200~400pg
2.5 mmol/LdNTP 溶液 8ul
誘變引物 10pmoles
低 Tm 值側引物 lOOpmoles
熱穩定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 單位）
加水至 100ul

如果廠商提供的熱穩定 DNA 聚合酶 10x 擴增緩沖液中不含 MgCl2, 加入所需體積的 0.1mol/L MgCl₂，使反應混合物中含有 DNA 聚合酶反應最適濃度的二價離子。

2. 如果熱循環儀沒有加熱蓋，加入一滴石蠟油（約 50ul) 覆蓋 PCR 反應。將反應管放置在熱循環儀中。

3. 用下表中給出的變性、退火、聚合反應所需的時間和溫度擴增核酸


上述反應條件適合于 0.5 ml 薄壁管和 100ul 反應體積，在 Perkin-Elmer 9600 9700, Master Cycler(Eppendorf) 或 PTC.100 (MJ Research) 熱循環儀上進行：使用其他類型的儀器或不同的反應體積時需調整上述反應條件。每1000bp 長的靶 DNA 聚合反應應進行 1 min。

4. 第一次 PCR 反應完成后再把下列成分加入到同一反應管中：

髙了 Tm 值的側引物 100pmoles
熱穩定 DNA 聚合酶 0.5ul(2.5 個單位）
2.5 mmol/LdNTP 溶液 3ul
用移液器溫和的上下吸打幾次混勻上述反應物。可離心幾秒鐘，將所有的試劑收集到離心管底部。
可以取 3~5ul 第一次 PCR 反應混合物，經瓊脂糖凝膠電泳快速分析證實是否成功的合成了大引物 PCR 產物。

5. 接下來進行第二輪擴增反應，反應由 25 個循環和二步溫度組成：

94°C,40S
72°C,90s 最后的延伸步驟為 72°C,5 min。

6. 取第二輪 PCR 擴增反應的 5% 進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳，估計擴增出的靶 DNA 濃度。
如果引物內設置了限制酶位點，用相應的限制酶消化擴增 DNA, 然后次級克隆進適合的載體。也可以將步驟 5 磷酸化的擴增 DNA 連接至限制酶消化后產生純端的質粒載體中。這種方法的誘變率大約為 80%, 通常僅需要挑選 6 個克隆進行 DNA 序列分析確認存在所希望的突變體，并肯定在 DNA 全序列中不存在其他的突變。