試劑、試劑盒 ATP結合緩沖液變性溶液二硫蘇糖醇EDTA乙醇激酶 連接酶緩沖液酚氯仿篩選緩沖液SDS醋酸鈉TET4 噬菌體 DNA 連接酶T4 噬菌體多核苷酸激酶合成的寡核苷酸[a-32P]ATP非變性聚丙烯酰胺凝膠
儀器、耗材 烤盤結晶皿平頭鑷子裝有防水黑墨水注射器硝酸纖維素濾膜Sephadex G-75 離心柱水浴Whatman 3 MM 濾紙
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液, 緩沖液和試劑的組分請見附錄 1。
將貯存液稀釋到適當的濃度。
ATP(100 mmol/L)
用 25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 稀釋 100 mml/L 貯存液分別配制 10 mmol/L 和 50 mmol/L 兩種濃度的 ATP 溶液。
10X 結合緩沖液
250 mmol/LHEPES(pH7.9)
30 mmol/LMgCl2
40 mmol/LKCl
含 1 mmol/L 二硫蘇糖醇的 lx 結合緩沖液
該溶液用于稀釋完全變性溶液以配制本節中一系列的洗液。請參見步驟 11~13 計算所需的溶液體積。
含 1 mmol/L 二硫蘇糖醇和 0.25% 脫脂奶粉的 1X 結合緩沖液
用于篩選的每張 82 mm 濾膜需要 1X 結合緩沖液大約 75 ml,138 mm 的濾要 180 ml。淸洗過程中勿減少使用該緩沖液體積。
含 5%(m/V) 脫脂奶粉的 1X 結合緩沖液
用于篩選的每張 82 mm 濾膜需要該封閉液 10 ml 或每張 138 mm 濾膜需要 25 ml。
含 0.25%(m/V) 脫脂奶粉的 1X 結合緩沖液
用于篩選的每張 82 mm 濾膜需要該封閉液 10 ml 或每張 138 mm 濾膜需要 25 ml。
1X 結合緩沖液
每張 82 mm 濾膜需要大約 10 ml 此種封閉液，毎張 138 mm 的濾膜需要 25 ml。
變性溶液（新鮮配制）
用 5 倍體積蒸餾水稀釋 10X 結合緩沖液（見上然后在所得 2X 結合緩沖液中加入適當的固體鹽酸胍配成 6mol/L 溶液。待鹽酸胍完全溶解后，用蒸餾水調整至 1X 結合緩沖液，再加入二硫蘇糖醇至終濃度為 1 mmol/L。用于篩選的毎張 82 mm 濾膜需要大約 15 ml 完全變性溶液（6mol/L) 或每張 138 mm 濾膜需要 25 ml。
二硫蘇糖醇（1mol/L)
EDTA(0.5 ml/L)
乙醇
10x 激酶/連接酶緩沖液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.6)
100 mmol/LMgCl2
酚: 氯仿（1:1，v/v)
篩選緩沖液
1x 結合緩沖液
0.25%(m/V) 脫脂奶粉
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
10ug/ml 變性鮭精 DNA 或鯡精 DNA
每張 82 mm 濾膜需要大約 10 ml 篩選緩沖液或每張 138 ml 濾膜需要 25 ml, 制備變性鮭精或鯡精 DNA 方法請見第 6 章方案 10。
SDS(20%m/V)
醋酸鈉（3mol/L，pH5.2)
TE(pH8.0)
酶和緩沖液
T4 噬菌體 DNA 連接酶
T4 噬菌體多核苷酸激酶
核酸和寡核苷酸
合成的寡核苷酸
20~25 個核苷酸長度的互補序列單鏈寡核苷酸按照第 10 章方案 1 所述進行凝膠電泳和 Sep-Pak 親和層析純化后，溶于 PH7.6 的 TE 溶液使終濃度為 0.2 mg/ml。重新退火時，寡核苷酸的中央區會在經凝膠滯留或 Southwestem 印跡的位置形成與靶蛋白結合的最佳雙鏈單體形式。在第二輪篩選中至少需要一個"突變"寡核苷酸的互補堿基對。當退火時，"突變"寡核苷酸雙體的中央區會形成最佳結合位點的缺損形式而不能結含靶蛋白。用一個陽性探針（最佳雙鏈結合序列）和一個陰性探針（密切相關但發生突變的雙鏈序列）進行連續篩選可以消除大多數假陽性。
兩對寡核苷酸應設計成具有突出、黏性末端，能夠互相連接。
放射活性化合物
[a-32P]ATP(10mCi/ml,5000Ci/mmole)
凝膠
非變性聚丙烯酰胺凝膠
請見步驟 7。
專用設備
用放射活性墨水或化學發光標記的黏性標簽重復使用的化學發光標記物可從 Strawgene (Glogos）購得。該標記可多次使用，只是在毎次新一輪自顯影前需曝光于熒光燈下。
烤盤（12 英寸 X8 英寸）
結晶皿
平頭鑷子
裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器
硝酸纖維素濾膜
Sephadex G-75 離心柱，用 TE(pH7.6) 溶液平衡
水浴事先調整至 16°C、65°C 和 85°C
Whatman 3 MM 濾紙
附加試劑
本方案步驟 8 和 10 所需試劑請見本章方案 1。
方法
放射性多聯體探針的制備
1. 分別制備兩個合成寡核苷酸的磷酸化反應，然后將兩者退火：
寡核苷酸 200ng
10X 激酶-連接緩沖液（DDT） 2.5ul
100 mmol/L 二硫蘇糖醇 (DDT) 2.5ul
32P ATP 100uCi
水 至 23ul
T4 噬菌體多核苷酸激酶 (8~10 單位/ul) 2.0ul
于 37°C 溫育 1 h。
2. 將兩個磷酸化反應混為一體，按以下步驟溫育混合物使寡核苷酸退火，若在一熱循環儀上進行則最方便
85°C 2 min
65°C 15 min
37°C 15 min
22°C 15 min
4°C 15 min
3. 加入 4ulT4 噬菌體 DAN 連接酶（lWeiss 單位/ul) 和 1ul 50 mml/L ATP, 于 16°C 溫育混合物 12 h。
4. 加入 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 至終濃度為 5mol/L。
5. 用柱層析法通過 Sephadex G-75 柱從未消耗的γ-32P, 單鏈寡核苷酸和未連接的雙鏈寡核苷酸中分離標記的寡核苷酸（請見附錄 8)。
6. 估計終探針的比活度。
標記探針比活度應為大于 2x106cpm/pmole
通過補平退火的未標記多聯體寡梭苷酸的 3'末端也可能獲得本節所需的比活度連接后，按第 10 章方案 7 所述建立末端補平反應，在每個反應中盡可能用 2 倍的 [a-32P]dNTF 以增加放射性標記產物的比活度。反應結束時，用親和層析柱從未消耗的 dNTP 中分離標記的寡梭苷酸（請見附錄 8)。
7. 利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影（請見附錄 9), 分析放射性標記 DNA 的大小。如果上述退火和放射性標記試驗一切順利，應見放射性標記的多聯體 DNA 呈階梯狀。
濾膜的制備
8. 制備含有λ噬菌體表達文庫的平板，完全按方案 1 步驟 1~8 所述將硝酸纖維素濾膜編號。
如有可能，盡量便用未經擴增的表達文庫。因為如果所需蛋白質對細菌有毒性或抑制重組噬菌體的生長，該克隆可能極少表達于擴增文庫中。
9. 用平頭鑷子（如 Millipore 鑷于）把編號的硝酸纖維素濾膜從噬菌斑上取出，與噬斑接觸的一面向上放到 Whatman3 MM 濾紙上。于室溫晾干 15 min。
10. 將第二張浸過 IPTG 的濾膜（已編號）放到菌苔上（見本方案步驟 4）。用一個 18 號針頭在每張濾膜上打孔標記，孔的位置與第一張濾膜上的位置相對應。于 37°C 繼續溫育 2 h, 然后取出濾膜按上述步驟于室溫晾干。
重要：以下步驟均在 4°C 進行。第一組濾膜不經鹽酸胍變性直接標記（即略去步驟 11~13), 而第二組濾膜按步驟 11~14 進行。
11. 將濾膜放進一個 12 英寸 X8 英寸的干烤皿里，其中盛有含 4°C 的變性液。于 4°C 在搖床平臺上緩慢搖動濾膜 5 min。棄去原變性液換上新鮮變性液。于再搖 5 min。
12. 把第二次加入的變性液傾入量筒中加入等體積含二硫蘇糖醇的 1X 結合緩沖液稀釋之。再將其倒入一個干凈的玻璃盤中，逐張將濾膜放入溶液中，注意務必使每張濾膜能與含二硫蘇糖醇的變性液充分接觸。
13. 按步驟 12 重復操作 4 次以上，每次均兩倍地稀釋變性液，使變性液中鹽酸胍的濃度依次為 3mol/L(步驟 11),1.5mol/L,0.75mol/L,0.375mol/L,0.187mol/L 和 0.094mol/L。最后用含二硫蘇糖醇的 1x 緩沖液洗滌濾膜 2 次。
14. 將兩組濾膜（即變性的和非變性的）都放在含 5% 脫脂奶粉的 1X 結合緩沖液中。于 4°C 緩緩搖動 30 min。
15. 用含 0.25% 脫脂奶粉的 1X 結合緩沖液洗滌濾膜。
用放射性探針探測固化蛋白質
16. 在一個結晶皿中，將步驟 5 獲得的 32P 標記的多聯體探針加到篩選緩沖液中配成的雜交溶液中（每張 82 mm 濾膜用 10 ml 或每張 138 mm 濾膜用 25 ml)。
在篩選反應中當標記探針（持異活性為 2xl08~5x108cpm/ug) 網的終濃度為 25ng/ml 時可以獲得最佳結果。然而. 如果探針的量有限，那么最低濃度可用到 2.5ng/ml。該法在最早應用時（Singh et al.1988),poly(dI:dC) 被作為一種非特異競爭物。當使用超聲處理的變性鮭精或小牛胸腺 DNA 時，一般可以降低背景。一些 DNA 結合的融合蛋白可能會被任何 DNA, 包括作為競爭模板的 DNA 或其他復合物所遮蔽。因此，在篩選前，應該在凝膠滯后實驗或 Southwestern 印跡時（請見第 17 章）先做對各種封閉劑如鮭精 DNA、poly(dl:dC)、poly(A) 及其他試劑的敏感性試驗。
17. 將濾膜轉移至結晶皿內的放射性標記探針溶液中。于 4°C 旋轉平臺上緩慢搖動 2~12 h。
本節所選用的結合/篩選緩沖液的離子成分使用于多種 DNA-蛋白質之間的相互作用，然而，在一些試驗中，也需要調整鹽和鎂離子的濃度，使其在凝膠滯后實驗或其他方法中結合條件最佳。本節推薦的可供選擇的一種結合緩沖液是含有 25 mmol/L HEPES(pH7.9)、25 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT(Singh1993) 的緩沖液。
18. 于 4°C 用大量體積（每 82 mm 濾膜用 25 ml, 每 138 mm 濾膜用 60 ml）含 lmmol/L 二硫蘇糖醇和 0.25% 脫脂奶粉的結合緩沖液將濾膜漂洗 5 min。
19. 重復步驟 18 兩次。
20. 棄去最后一次清洗的緩沖液。將濕濾膜放在一張 Saran 包裝膜上，蓋上一張 Saran包裝膜。再在 Saran 包裝膜若干不對稱的位置上貼上放射性墨水或化學發光標記的黏性標簽紙。
用 Scotch 膠帶覆蓋放射性標簽，以防止放射性墨水污染 X 射線膠片夾或增感屏。
21. 按附錄 9 進行放射自顯影。
22. 挑選陽性斑，并按本方案導言所述用特異和非特異探針復篩。
可通過重復變性復性過程從濾膜上移去探針，從而濾膜可與其他 DNA 結合蛋白質 cDNA 再雜交。