初代細胞培養實驗

組織

Hanks 培養液 胰蛋白酶

吸管 平皿 培養瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計數板

1.  準備

取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；

2.  布局

點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應通過火焰）；

3.  處理組織

把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；

4.  剪切

用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞；

5.  消化

或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；

6.  分離

在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續進行消化）；低速（500~1000 轉/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養液）；

7.  計數

用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中；對大多數細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO₃調整；

8.  培養

置入36.5 ℃溫箱培養；如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。

組織塊、胰蛋白酶、培養液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養時再攜入操作野；如預先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作時宜挽上袖口）。

最常用的初代培養有組織塊培養和分散細胞培養。組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進行培養。分散細胞培養則是將組織塊用機械法或化學法使細胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細胞，經典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca^2＋，再經機械輕度振蕩，使之成為單細胞。

參考《組織培養和分子細胞學技術》北京出版社