分子生物學常用實驗技術（page2)

一、RNA 制備
　　模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC 是RNA 酶的化學修飾劑,它和RNA 酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC 與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。

　　試驗所用試劑也可用DEPC 處理,加入DEPC 至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10 分鐘,再煮沸15 分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC 也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA 活性。但DEPC 能與胺和巰基反應,因而含Tris 和DTT 的試劑不能用DEPC 處理。Tris 溶液可用DEPC 處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC 處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC 外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經硅烷化處理。
細胞內總RNA 制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA 提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA 流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA 被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA 被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA 第一鏈的合成
　　所有合成cDNA 第一鏈的方法都要用依賴于RNA 的DNA 聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney 鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV 反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA 的DNA 合成,依賴于DNA 的DNA 合成以及對DNA:RNA 雜交體的RNA 部分進行內切降解(RNA 酶H 活性)。MLV 反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA 和依賴于DNA 的DNA 合成活性,但降解RNA NA 雜交體中的RNA 的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV 反轉錄酶差。MLV 反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV 反轉錄酶利用RNA 模板合成cDNA 時的最適pH 值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。AMV 反轉錄酶和MLV 反轉錄酶都必須有引物來起始DNA 的合成。cDNA 合成最常用的引物是與真核細胞mRNA 分子3'端poly(A)結合的12-18 核苷酸長的oligo(dT)。

三、cDNA 第二鏈的合成
　　cDNA 第二鏈的合成方法有以下幾種:
(1) 自身引導法合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA 雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段或反轉錄酶合成cDNA 第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1 核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1 核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 5'端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。
(2) 置換合成法該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA 雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP 存在下,利用RNA 酶H 在雜交鏈的mRNA 鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA 引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3 個主要優點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1 核酸酶來切割雙鏈cDNA 中的單鏈發夾環。目前合成cDNA 常采用該方法。

四、cDNA 的分子克隆
　　已經制備好的雙鏈cDNA 和一般DNA 一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG 和dC 或dT 和dA 尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA 也可以經PCR 擴增后再克隆入適當載體。

第二節動植物組織mRNA 提取
一、材料
　　 水稻葉片或小鼠肝組織。

二、設備
　　研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑
1、無RNA 酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。
2、75%乙醇：用DEPC 處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。
3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步驟
（一）動植物總RNA 提取-Trizol 法
　　Trizol 法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA 絕無蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg 組織加入1ml Trizol 液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol 體積的10%。
2、研磨液室溫放置5 分鐘，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒。
3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol 液加0.5ml 異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 分鐘，12000g 離心10 分鐘。
4、棄去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5 分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10 分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度。然后將RNA 溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶10 分鐘。RNA 可進行mRNA 分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
　　　　2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA 提取
　　由于mRNA 末端含有多poly(A)+，當總RNA 流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，
mRNA 被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA 可被洗下，經過兩次
oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH 懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC 處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯
德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3 倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。
3、用1x 柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。
4、將（一）中提取的RNA 液于65℃溫育5 分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x 柱層析緩沖
液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA 溶液進入柱床后，加入1 倍柱床體積的1x 層析
柱加樣溶液。
5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD 為0 時，加入2-3 倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以
1/3 至1/2 柱床體積分管收集洗脫液。
6、測定OD260，合并含有RNA 的洗脫組分。
7、加入1/10 體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30 分鐘。
8、4℃下12000g 離心15 分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g 離心
5 分鐘。
9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10 分鐘，或真空干燥10 分鐘。
10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
　　　2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH 洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH 水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。第三節植物病毒RNA 提取大多植物病毒RNA 為單鏈RNA，并且其極性與mRNA 極性相同，植物病毒RNA 提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。

一、材料
　　提純TMV 病毒液（10mg/ml）。

二、設備
　　冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑
　　TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液，無RNA 酶的雙菌水。

四、操作步驟
1、取一eppendorf 管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1 分鐘，4℃下12000g 離心10 分鐘。
2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。
3、吸取水相于新eppendorf 心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12000g 離心10 分鐘。
4、取水相，加入1/10 倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
5、4℃下12000g 離心15 分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g 離心5分鐘。
6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5 分鐘或空氣干燥10 分鐘，并溶于無RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7、取10ml 進行電泳分析，另10ml 用于cDNA 合成。
[注意] 1、整個操作應盡可能在低溫下進行。
　　　 2、由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。

第四節cDNA 合成技術
一、Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技術
　　Promega 公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系統采用M-MLV 反轉錄酶的RNase H 缺失突變株取代AMV 反轉錄酶,使合成的cDNA 更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV 反轉錄酶,cDNA 第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH 和DNA 聚合酶Ⅰ進行置換合成,最后用T4 DNA 聚合酶切去單鏈末端,方法簡便易行。該系統試劑包括：
　　20μg 特異性引物
　　200μl M-MLV 第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃時); 375mmol/l KCl;
　　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各2.5mmol/L)
　　2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制劑
　　10,000μ M-MLV 反轉錄酶, RNase H-5μg 對照RNA
　　400μl M-MLV 第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：
　　400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
　　30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
　　500μ RNase H
　　500μ DNA 聚合酶Ⅰ
　　100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ
　　2×1.25ml 不含核酸酶的水
　　以上所有試劑除對照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

（一） 第一鏈合成
1. 試劑
　　[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液。
2. 操作步驟
　　(1) 取一滅菌的無RNA 酶的eppendorf 管,加入RNA 模板和適當引物,每μg RNA 使用0.5μg 引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O 調整體積至15μl, 70℃處理5 分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入5×第一鏈緩沖液5μlrRNasin RNA 酶抑制劑25UM-MLV(H- )反轉錄酶200UH2 O 調至總體積25μl
　　(2) 用手指輕彈管壁,吸取5μl 至另一eppendorf 管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),
用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
　　(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1 小時
　　(4) 取出置于冰上
　　(5) 摻入測定的eppendorf 管加入95μl 50mM EDTA 終止反應,并使總體積為100μl。可取90μl 進行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl 進行同位素摻入放射性活性測定。第一鏈合成eppendorf 管可直接用于第二鏈合成
　　注：以上25μl 反應總體積中所用RNA 量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴大反應體積, 倒5μg RNA 使用125μl 總體積進行合成。

（二） 第二鏈合成
1、取第一鏈反應液20μl, 再依次加入10×第二鏈緩沖液20μ　　lDNA 聚合酶Ⅰ 23μ　　RNase H 0.8μH2O 　　加至終體積為100μl
2、輕輕混勻,如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定,可取出10μl 至另一eppendorf 管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃溫浴2 小時(如需合成長于3kb 的cDNA, 則需延長至3-4 小時)。
4、摻入測定eppendorf 管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl 進行同位素摻入放射性測定,余下的可進行電泳分析。
5、cDNA 第二鏈合成離心管反應液70℃處理10 分鐘, 低速離心后置冰上。
6、加入2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃溫浴10 分鐘。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA 終止反應。
8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA 反應液,離心2 分鐘。
9、水相移至另一eppendorf 管,加入0.5 倍體積的7.5M 醋酸銨(或0.1 倍體積的1.5M 醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5 倍體積的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30 分鐘后離心5 分鐘。
10、小心丟去上清液,加入0.5ml 冰冷的70%乙醇,離心2 分鐘。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于10-20μl TE 緩沖液。

（三）同位素摻入放射性活性測定、計算和電泳分析
1. 試劑
　　1mg/ml 鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mMNaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍）。
2. 操作步驟
(1) 各取一2(5)中和二(4)反應液各3μl,點于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。
(2) 同樣各取3μl 中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA 中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30 分鐘。
(3) 用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5% TCA 洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml 丙酮或乙醇漂洗,這些樣品代表摻入放射性活性。
(4) 分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數。
3. 第一鏈產量測定
第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%
摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應體積(μl)×(第一鏈摻入率)
設330 為每mol dNTP 的平均分子量
合成cDNA 量(ng)=摻入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA 向cDNA 轉變率=合成cDNA 量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%
例如總放射性活性強度為254,000cpm, 摻入放射性活性強度為3040cpm, 所用RNA 摸板量為1μg,反應體積為25μl, 則:
摻入率＝3040/254000×100%=1.2
摻入dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA 向cDNA 轉變率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于摻入測定,而反應體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA 合成量為0.8×198ng=158ng。
4. 第二鏈產量計算
除需去除第一鏈摻入dNTP 外,方法同第一鏈產量計算
第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性??
摻入dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反應體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率
第二鏈cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
雙鏈cDNA 轉變率=雙鏈cDNA 合成量(ng)/ 單鏈cDNA 合成量(ng)
例: 第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp, 總放射性活性強度為235000cpm.
第二鏈摻入率=2780/235000×100%=1.18%
第二鏈合成dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二鏈cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
雙鏈cDNA 轉變率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA 第一鏈轉變率和雙鏈轉變率以12-50%和50-200%為好。

（四） 電泳分析
　　通常合成的cDNA 第一鏈和第二鏈長度為350-6000 堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的9-12 步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。

1. 標準分子量DNA 參照物的同位素標記
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA 聚合酶進行32 P 標記
10×HindⅢ緩沖液2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ標準DNA 1μg
Klenow DNA 聚合酶1μ
加H2O 到總體積25μl
(2) 室溫放置10 分鐘, 加2.5μl 200mM EDTA 終止反應, 加入2×樣品緩沖液,貯存于-20℃。
2. 電泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA 制備1.4%的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30 分鐘。
(2) 取樣品液, 用TE 調整體積, 使第一鏈和第二鏈產率測定液的體積相同,加入等體積的2×樣品緩沖液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉蘭）。
(3) 加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3 處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/LEDTA。
(4) 將膠浸入7% TCA 中,室溫放置30 分鐘(直至染料由藍色變至黃色),取出置濾紙上,干燥數小時。
(5) 用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X 光片(用增感屏時-70℃壓片)。

二、其它cDNA 合成技術
　　除Riboclone M-MLV(H-)cDNA 合成技術外，Promega 公司還提供有多個AMV 合成試劑盒，不同試劑盒所提供的引物或引物一延接頭(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、隨機引物、XbaⅠ引物-延接頭、NotⅠ引物-延接頭等，其余試劑一樣，這些系統包括：
20mg 引物
20ml 5×第一鏈緩沖液, 配方如下：
250mmol/L Tris?Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
MgCl2; 2.5mmol/L 亞精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM 焦碳酸鈉
625m rRNasin RNA 酶抑制劑
600m AMV 反轉錄酶
5mg 1.2kb 對照RNA
200ml 10×第二鏈緩沖液，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
2m E.Coli RNaseH
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一鏈合成
　　下面介紹的是25ml 體積反應系統，該系統可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反應體積10ml，如5mg mRNA 需55ml 反應體積。引物或引物-延接頭和反轉錄酶與mRNA 的比例應分別保持為0.5mg/mg（對NotⅠ引物-延接頭
為0.3mg/mg）和15m/mg.
1、試劑：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM 和200mM)，TE 飽和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE 緩沖液(10mM Tris?Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
2、操作步驟：
（1）取一滅菌的無RNA 酶的eppendorf 管加入的RNA 樣品，及引物或引物-延接頭，用H2O 調節0.5mg 引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5 分鐘，待冷至室溫，離心數秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入：
5×第一鏈緩沖液5mlrRNasinR RNA 酶抑制劑25ml
40mM 焦碳酸鈉2.5ml
AMV 反轉錄酶15m/mg RNA
加無水RNA 酶水至總體積25ml
　　在加入焦碳酸鈉和AMV 反轉錄酶前，需將反應液42℃溫浴5 分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。焦碳酸鈉主要用于抑止第一鏈形成發夾結構。
（2）輕彈eppendorf 管，取出5ml 至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
（3）42℃溫浴1 小時。
（4）取出置冰上。
（5）摻入測定的eppendorf 管加入50mM EDTA，終止反應，并使總體積為100ml。可取90ml進行電泳分析，另10ml 進行同位素摻入測定。
（6）第一鏈合成離心管可直接用于第二鏈合成

（二）第二鏈合成
　　第二鏈合成可在第一鏈合成反應液中直接進行。
1、第一鏈反應液（20ml）中依次加入
10X 第二鏈緩沖液10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m
加無核酸酶水至總體積100ml
余下步驟同本章第四節一（二）2-12 步及（三）和（四）。
思考題:
1. 為什么mRNA 提取是cDNA 合成成敗的關鍵？
2. 試比較自導引導法和置換合成法合成cDNA 的優缺點。

第五章重組質粒的連接、轉化及篩選

第一節概述

　　質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的DNA 片段(＜10kb)且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內切酶切割質粒DNA 和目的DNA 片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源DNA 的重組質粒和無插入而自身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如α互補現象等來鑒別重組子和非重組子。外源DNA 片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA 片段，一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR 擴增時，在DNA 片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質粒載體DNA 均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調整連接反應中兩種DNA 的濃度, 以便使正確的連接產物的數量達到最高水平。還可將載體DNA 的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質粒DNA 的自身環化。帶5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入E. coli 受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生，或由DNA 聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T4 DNA 連接酶的濃度和外源DNA 及載體DNA 濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA 分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。特殊情況下，外源DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體末端或外源DNA 片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。

　　本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS,轉化受體菌為E. coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ 基因,故重組子的篩選采用Amp 抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。因pBS 帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pBS DNA 的轉化子才能在含有Amp 的LB 平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。pBS 上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ 的閱讀框架,不影響其正常功能。E. coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pBS 和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS 和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+ 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到pBS 質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去α-互補能力, 因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養基上，α-互補產生的Lac+細菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養基中的乳糖，產生乳酸，使pH 下降，因而產生紅色菌落，而當外源片段插入后，失去α-互補能力，因而不產生β-半乳糖苷酶，無法分解培養基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA 分開。此為α-互補現象篩選。

第二節材料、設備及試劑

一、材料
　　外源DNA 片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA 溶液,濃度已知; 載體DNA: pBS 質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM 系列等具有α-互補能力的菌株。
二、設備
　　恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋， 瓊脂糖凝膠電泳裝置， 電熱恒溫培養箱，電泳儀無菌，工作臺， 微量移液槍，eppendorf 管。
三、試劑
1、連接反應緩沖液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(組分V.Sigma 產品）（可用可不用），10mol/L ATP（過濾滅菌）。
2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。
3、X-gal 儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml 的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。
4、IPTG 儲液(200mg/ml): 在800μl 蒸餾水中溶解200mg IPTG 后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm 濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf 管并儲于-20℃。
5、麥康凱選擇性培養基(Maconkey Agar)：取52g 麥康凱瓊脂加蒸餾水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp 儲存液使終濃度為50mg/ml，然后搖勻后涂板。
6、含X-gal 和IPTG 的篩選培養基：在事先制備好的含50μg/ml Amp 的LB 平板表面加40ml X-gal儲液和4μlIPTG 儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4 小時,使培養基表面的液體完全被吸收。
7、感受態細胞制備試劑: 見第三章。
8、煮沸法快速分離質粒試劑: 見第一章。
9、質粒酶及電泳試劑: 見第二章。

第三節操作步驟

一、連接反應
1、取新的經滅菌處理的0.5ml eppendorf 管, 編號。
2、將0.1μg 載體DNA 轉移到無菌離心管中，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA 片段。
3、加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5 分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫8-24 小時。
同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA 片段沒有質粒載體。

二、E. coli DH5α感受態細胞的制備及轉化
　　每組連接反應混和物各取2μl 轉化E. coli DH5α感受態細胞。具體方法見第三章。

三、重組質粒的篩選
1、每組連接反應轉化原液取100μl 用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上,37℃下培養半小時以上,直至液體被完全吸收。
2、倒置平板于37℃繼續培養12-16 小時,待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。
3、放于4℃數小時,使顯色完全（此步麥康凱培養基不做）。不帶有pBS 質粒DNA 的細胞,由于無Amp 抗性,不能在含有Amp 的篩選培養基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養基上呈現為紅色菌落。在X-gal 和ITPG培養基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱選擇性培養基和x-gal 和ITPG 培養基上均為白色菌落。

四、酶切鑒定重組質粒
　　用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml 的5ml LB 液體培養基中,37℃下振蕩培養12 小時。使用煮沸法快速分離質粒DNA 直接電泳，同時以煮沸法抽提的pBS 質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS 慢。再用與連接未端相對應的限制性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。
[注意] 1、DNA 連接酶用量與DNA 片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100 倍。
2、在連接帶有粘性末端的DNA 片段時，DNA 濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA 濃度至100-200mg/ml。
3、連接反應后，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2 個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。
4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA 連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。
5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA 片段（2-5 倍），這將有助于減少載體的自身環化，增加外源DNA 和載體連接的機會。
6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA 的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。
7、X-gal 是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（ b-galactosidase) 水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG 是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ 的表達。
8、在含有X-gal 和IPTG 的篩選培養基上，攜帶載體DNA 的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養后放于冰箱3-4 小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。

思考題
1. 在用質粒載體進行外源DNA 片段克隆時主要應考慮哪些因素？
2. 利用α－互補現象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？

第六章基因組DNA 的提取

第一節概述

　　基因組DNA 的提取通常用于構建基因組文庫、Southern 雜交(包括RFLP)及PCR 分離基因等。利用基因組DNA較長的特性,可以將其與細胞器或質粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA 即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中, 可用玻棒將其取出，而小分子DNA 則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部, 從而達到提取的目的。在提取過程中,染色體會發生機械斷裂,產生大小不同的片段,因此分離基因組DNA 時應盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩, 以保證得到較長的DNA。一般來說,構建基因組文庫, 初始DNA 長度必須在100kb 以上,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進行RFLP 和PCR 分析, DNA 長度可短至50kb, 在該長度以上,可保證酶切后產生RFLP 片段(20kb 以下),并可保證包含PCR 所擴增的片段(一般2kb 以下)。不同生物（植物、動物、微生物）的基因組DNA 的提取方法有所不同; 不同種類或同一種類的不同組織因其細胞結構及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA 時必須參照文獻和經驗建立相應的提取方法, 以獲得可用的DNA 大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質對隨后的酶切、PCR 反應等有較強的抑制作用,因此用富含這類物質的材料提取基因組DNA 時, 應考慮除去多糖和酚類物質。本實驗以水稻幼苗(禾本科)、李(蘋果)葉子、動物肌肉組織和大腸桿菌培養物為材料,學習基因組DNA 提取的一般方法。

第二節從植物組織提取基因組DNA

一、材料
　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。

二、設備
　　移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml 離心管（有蓋）及5ml
和1.5ml 離心管，彎成鉤狀的小玻棒。

三、試劑
1、提取緩沖液Ⅰ：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取緩沖液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul 巰基乙醇，加水
至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、RnaseA 母液：配方見第一章。
5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE 緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步驟：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA 提取
1. 在50ml 離心管中加入20ml 提取緩沖液Ⅰ, 60℃水浴預熱。
2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60℃水浴保溫30-60 分鐘(時間長,DNA 產量高), 不時搖動。
3. 加入20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10 分鐘,使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。
4. 室溫下5000rpm 離心5 分鐘。
5. 仔細移取上清液至另一50ml 離心管,加入1 倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現絮狀DNA 沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf 中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA 絮團,在干凈吸水紙上吸干,轉入含TE 的離心管中,DNA 很快溶解于TE。
7. 如DNA 不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm 離心5 分鐘, 再將沉淀移入TE 管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60℃水浴放置15 分鐘以上，以幫助溶解。
8. 將DNA 溶液3000rpm 離心5 分鐘, 上清液倒入干凈的5ml 離心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分鐘, 除去RNA(RNA 對DNA 的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。
10. 加入1/10 體積的3mol/L NaAc 及2×體積的冰乙醇,混勻,-20℃放置20 分鐘左右,DNA 形成絮狀沉淀。
11. 用玻棒撈出DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。
12. 將DNA 重溶解于1ml TE, -20 貯存。
13. 取2μl DNA 樣品在0.7% Agarose 膠上電泳, 檢測DNA 的分子大小。同時取15μl 稀釋20倍, 測定OD260/OD280, 檢測DNA 含量及質量。
[注意] 5g 樣品可保證獲得500μg DNA, 足供RFLP、PCR 等分析之用。

（二）. 從李(蘋果)葉子提取基因組DNA
1. 取3-5 克嫩葉, 液氮磨成粉狀。
2. 加入提取緩沖液Ⅱ10ml, 再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混勻。65℃, 30-60min, 常搖動。
4. 同本節（一）中步驟3-13 操作。

第三節從動物組織提取基因組DNA
一、材料
　　哺乳動物新鮮組織。

二、設備
　　移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。

三、試劑
1、分離緩沖液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步驟:
1. 切取組織5g 左右,剔除結締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml 分離緩沖液。
3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時樣品變得很粘稠。
4. 加50ul 或1mg 蛋白酶K, 37℃保溫1-2 小時, 直到組織完全解體。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm 離心數秒鐘。
6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm 離心5 分 鐘。
7. 取上層水相至干凈離心管, 加2 倍體積乙醚抽提(在通風情況下操作)。
8. 移去上層乙醚,保留下層水相。
9. 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2 倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20 分鐘，DNA 沉淀形成白色絮狀物。
10. 用玻棒鉤出DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。
11. 如果DNA 溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm 短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保溫30 分鐘, 用酚抽提后, 按步驟9-10 重沉淀DNA。

第四節細菌基因組DNA 的制備
一、材料
　　細菌培養物。

二、設備
　　移液管, 高速冷凍離心機, 臺式離心機，水浴鍋。

三、試劑
1、