第三章大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化
第一節概述
在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內,但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob
基因,因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。
轉化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。
轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA
分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2
,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA 分子進入的感受態細胞(Compenent
cells)。進入受體細胞的DNA 分子通過復制,表達實
現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA
分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2
和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高,但CaCl2
法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2
法為使用更廣泛。
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1.
細胞生長狀態和密度:
不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600
來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5 時,細胞密度在5×107 個/ml
左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA
應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA 的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA
的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA
溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。
4.
防止雜菌和雜DNA 的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管,
tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA
的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。本實驗以E.coli DH5a 菌株為受體細胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態,然后與pBS
質粒共保溫,實現轉化。由于pBS 質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp
抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp 的培養基上不能生長。能在Amp
培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。本實驗以E.coli
DH5a 菌株為受體細胞,并用CaCl2 處理,使其處于感受態,然后與pBS 質粒共保溫,實現轉化。由于pBS
質粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr )，可通過Amp 抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pBS，則在含Amp 的培養基上不能生長。能在Amp
培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pBS。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提取出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。
第二節材料、設備及試劑
一. 材料
E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS 質粒DNA: 購買或實驗室自制，eppendorf 管。
二. 設備
恒溫搖床,電熱恒溫培養箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,微量移液槍。
三. 試劑
1.LB 固體和液體培養基：配方見第一章。
2.Amp 母液：配方見第一章。
3.含Amp 的LB 固體培養基:將配好的LB 固體培養基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp 儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。
4.麥康凱培養基(Maconkey Agar):取52g 麥康凱瓊脂,加蒸餾水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高壓滅菌，待冷至60℃左右加入Amp 儲存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。
5.0.05mol/L CaCl2 溶液:稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml 重蒸水中,定容至100ml,高壓滅菌。
6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水,分析純),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高壓滅菌。
第三節操作步驟
一、受體菌的培養
從LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落,接種于3-5ml LB 液體培養基中,37℃下振蕩培養12
小時左右,直至對數生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50 的比例接種于100ml LB 液體培養基中,37℃振蕩培養2-3 小時至OD600
＝0.5 左右。
二、感受態細胞的制備( CaCl2 法)
1、將培養液轉入離心管中,冰上放置10 分鐘,然后于4℃下3000g 離心10 分鐘。
2、棄去上清,用預冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml 輕輕懸浮細胞,冰上放置15-30 分鐘后,4℃下3000g 離心10 分鐘。
3、棄去上清,加入4ml 預冷含15%甘油的0.05mol/L 的CaCl2 溶液,輕輕懸浮細胞,冰上放置幾分鐘,即成感受態細胞懸液。
4、感受態細胞分裝成200μl 的小份,貯存于-70℃可保存半年。
三、轉化
1、從-70℃冰箱中取200μl 感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。
2、加入pBS 質粒DNA 溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30 分鐘后。
3、42℃水浴中熱擊90 秒或37℃水浴5 分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5 分鐘。
4、向管中加入1ml LB 液體培養基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養1 小時,使細菌恢復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp 的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿,37℃培養16-24 小時。
同時做兩個對照:
對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA 溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB 平板上應沒有菌落出現。
對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
四、計算轉化率
統計每個培養皿中的菌落數。
轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：
轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／涂板菌液體積
轉化頻率（轉化子數／每mg 質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA 加入量(mg)
感受態細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／涂板菌液體積
感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數
[注意] 本實驗方法也適用于其它E.coli 受體菌株的不同的質粒DNA 的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。
思考題
1. 制備感受態細胞的原理是什么？
2. 如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現象？