三、菌落原位雜交
對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。
1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。
2、設備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。
3、試劑：
(1)LB 固體培養基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris?Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris?Cl。
預洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)預雜交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。其余試劑：與Southern 雜交相同。
4、操作步驟：
1. 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm 的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3 個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。
(5) 用Parafilm 膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應的結果。裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA 結合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA 結合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH 的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3 分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH 重復步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris?Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5 分鐘后吸干濾膜, 再重復一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris?Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5 分鐘后吸干濾膜,轉移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30 分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2 小時,固定DNA。將固定在膜上的DNA 與32 P 標記的探針雜交。
５.雜交
(1) 盛有2×SSC 的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5 分鐘。
(2) 將濾膜轉到200ml 預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養箱內的旋轉平臺上。于50℃處理30 分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交
信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉到盛有150ml 預雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在
50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預雜交1-2 小時。
(5)
將32 P 標記的雙鏈DNA 探針于100℃加熱5
分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。雜交結束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC
和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5 分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗一次，同時應避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml
1×SSC 和0.1% SDS 溶液洗膜兩次,每次1-1.5
小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC 和0.1% SDS
的溶液于68℃將濾膜浸泡60
分鐘。把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X 光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16 小時。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。
四、斑點雜交
斑點雜交是指將DNA
或RNA 樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA
或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA 或RNA
的方法,在基因分析和基因診斷中經常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區分目的序列信號和干擾信號。
1、材料：待分析的DNA 或RNA 樣品，已標記的探針。
2、設備：狹槽點樣器，真空泵，恒溫水浴，真空烤箱等。
3、試劑：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纖維素濾膜。
（6）濾紙。
4、操作步驟：
(1) 10μl 樣品與20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC 混合。混合置于68℃，15分鐘后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH 清洗點樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經20×SSC 浸潤的濾紙鋪在點樣器上,上面再鋪上一張經20×SSC 浸潤1 小時的硝酸纖維素濾膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。
(3) 用10×SSC 清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣于孔中。外圍幾個孔中加2μl 染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC 清洗兩次。繼續抽吸5 分鐘,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘干2 小時。按上述Southern 或Norhtern 雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時應注意濾膜必須干燥，并覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以后的操作困難。
2、在雜交過程中，整個濾膜應一直是濕潤的，不得干涸。第三節雜交反應的條件及參數的優化
不同的反應條件對雜交結果的影響如下：
(1) 根據雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA 在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3)
選用不同的封閉試劑：如Denhardt's 試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA
或酵母DNA，并和SDS 一起使用。與Denhardt's 試劑相比,BLOTTO 價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結果，但它不能用于RNA
雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's 試劑比用BLOTTO
能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應時,連續的輕微振蕩可獲得較好的雜交結果。
(5)
在雜交過程中加入其他化合物, 如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10
倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA
量很少,或放射性探針的量有限,
一般不用硫酸葡聚糖或PEG。根據探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）,
反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting
temperature, Tm )是指在雙鏈DNA 或RNA 分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G?C
堿基對的序列比富含A?T 堿基對序列的Tm 溫度高。有關Tm 的計算方法，請參考第八章。
(7)
根據標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。在水溶液中雜交時,用6×SSC 或6×SSPE
溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時,應該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。上述這些條件的改變，對雜交的結果有不同的影響，應根據研究的具體情況，選用適當的方法。
思考題：
1、核酸探針的標記方法有哪些？
2、要獲得好的雜交結果，需注意哪些因素？
3、如果放射自顯影后，如X-光片背景很黑，請分析原因及寫出預防措施。