第九章分子雜交技術
互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA
分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA
或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交,
即細胞原位雜交。探針必須經標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素,
但由于同位素的安全性，近年來發展了許多非同位素標記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用,而且在臨床診斷上的應用也日趨增多。
第一節核酸探針標記的方法
核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA
和RNA
探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。
一、雙鏈DNA 探針及其標記方法
分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA 探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA 探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
1.
切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA 分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA
聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA
鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500
個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP 的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。DNA
酶Ⅰ的用量和E.coli DNA 聚合酶的質量會影響產物片段的大小。DNA 模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。
材料： 待標記的DNA。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml
BSA。
(2)未標記的dNTP 原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3 種分別溶解于50mmol/L
Tris?Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP 或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA 聚合酶Ⅰ(4 單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L
Tris?Cl(pH7.5)中。
(5)DNA 酶Ⅰ:1mg/ml。
EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液5μl
待標記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP 或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA 聚合酶4 單位
DAN 酶I 1μl
加水至終體積50μl
(2) 置于15℃水浴60 分鐘。
(3) 加入5μl EDTA 終止反應。
(4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意] 1、3H，32P 及35S 標記的dNTP 都可使用于探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA 酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA 酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。
2.
隨機引物合成法隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA 模板結合,在Klenow 酶的作用下,合成DNA
探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常,產物平均長度為400-600
個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow
片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA
模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg 探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
材料：待標記的DNA 片段。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。
(2)10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow 片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未標記的dNTP 溶液：dGTP、dCTP 和dTTP 溶液，各5mmol/L。
[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)緩沖液A：50mmol/L Tris?Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5%
SDS。
操作步驟:
(1) 200ng 雙鏈DNA(1μl)和7.5ng 隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf 管內,水浴煮沸5 分鐘后，立即置于冰浴中1 分鐘。
(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf 管內混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未標記的dNTP 溶液1μl
10×隨機標記緩沖液1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 將步驟(1)eppendorf 管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5 單位(約1μl) Klenow 片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g 離心1-2 秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16 小時。
(5) 在反應液中加入10μl 緩沖液A 后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA 應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。
二、單鏈DNA 探針
用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA
時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定,即形成自身的無效雜交,結果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA
探針的合成方法主要有下列兩種1) 以M13 載體衍生序列為模板,用Klenow 片段合成單鏈探針; (2) 以RNA 為模板,
用反轉錄酶合成單鏈cDNA 探針。
1. 從M13 載體衍生序列合成單鏈DNA 探針合成單鏈DNA
探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在[a-32P]-dNTP
的存在下,由Klenow
片段作用合成放射標記探針，反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長短不一的產物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF
型M13 DNA 也可用于單鏈DNA 的制備,選用適當的引物即可制備正鏈或負鏈單鏈探針。
材料：已制備好的單鏈DNA 模板（方法參見第十章中有關內容）。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×Klenow 緩沖液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris?Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT 溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L 和20mmol/L 的未標記的dNTP 溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP 各20mmol/L 的溶液。
Klenow 片段（5 單位/ml）。
(7)適宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步驟：
(1)在0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：
單鏈模板（約0.5pmol） 1mg
適當引物5pmol
10×Klenow 緩沖液3ml
加水至20ml
(2)將eppendorf 管加熱到85℃ 5 分鐘，在30 分鐘內，使小離心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未標記的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP 混合液1ml
混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。
(4)加1ml（5 單位）Klenow 酶室溫下30 分鐘。
(5)加1ml20mmol/L 未標記的dATP 溶液20 分鐘。68℃加熱10 分鐘，使Klenow 片段失活。調整NaCl 濃度，使之適宜于酶切。
(7)加入20 單位限制性內切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1 小時。酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP 或加0.5mol/LEDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。
(9)用電泳方法分離放射性標記的探針。