第八章聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
第一節概述
PCR(Polymerase
Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA 或RNA 的方法.它包括三個基本步驟: (1)
變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94℃下解鏈; (2)
退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)
延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最適溫度下,以目的DNA
為模板進行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環,理論上每一輪循環將使目的DNA 擴增一倍（圖4）,這些經合成產生的DNA
又可作為下一輪循環的模板,所以經25-35 輪循環就可使DNA 擴增達106 倍。
一、PCR 反應中的主要成份
1.
引物：PCR 反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR 成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA
序列區域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp，
太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。(2)
引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3)
四種堿基應隨機分布，在3'端不存在連續3 個G 或C,因這樣易導致錯誤引發。(4)
引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。(5) 在引物內,
尤其在3'端應不存在二級結構。兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4
個連續堿基的同源性或互補性。(7) 引物5'端對擴增特異性影響不大,
可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.
通常應在5'端限制酶位點外再加1-2 個保護堿基。引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構,
以免產生非特異性擴增,影響產量。(9) 簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met,
3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物。一般PCR
反應中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體, 過低則降低產量。利用紫外分光光度計,
可精確計算引物濃度, 在1cm 光程比色杯中,260nm 下,引物濃度可按下式計算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4 種不同堿基個數。
2.
4 種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP 應用NaOH 將pH 調至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度.dNTP
原液可配成5-10mmol/L 并分裝,-20℃貯存。一般反應中每種dNTP 的終濃度為20-200μmol/L。理論上4 種dNTP
各20μmol/L,足以在100μl 反應中合成2.6μg 的DNA。當dNTP 終濃度大于50mmol/L 時可抑制Taq DNA
聚合酶的活性.4 種dNTP 的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP 的不足出現的錯誤摻入。
3.
Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA 聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度,
影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR 反應,可以用0.1-5mmol/L
的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗,選出最適的Mg2+濃度。在PCR 反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團,
例如磷酸基團或EDTA 等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證最適Mg2+ 濃度。
4. 模板：PCR 反應必須以DNA
為模板進行擴增, 模板DNA
可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環狀分子(線狀分子比環狀分子的擴增效果稍好).就模板DNA 而言,影響PCR
的主要因素是模板的數量和純度.一般反應中的模板數量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1μg 的人基因組DNA,10ng
的酵母DNA,1ng 的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少.靈敏的PCR 可從一個細胞,一根頭發,一個孢子或一個精子提取的DNA
中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產物.DNA 中的雜質也會影響PCR 的效率。
5. Taq DNA
聚合酶：一般Taq DNA 聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃
5min.現在人們又發現許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間.Taq DNA
聚合酶的酶活性單位定義為74℃下,30min,摻入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量.Taq DNA
聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率,一般PCR 中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環,在利用PCR 克隆和進行序列分析時尤應注意.在100μl
PCR 反應中,1.5-2 單位的Taq DNA 聚合酶就足以進行30
輪循環.所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減.酶量過多會使產物非特異性增加,過少則使產量降低.反應結束后,如果需要利用這些產物進行下一步實驗,需要預先滅活Taq
DNA 聚合酶, 滅活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2) 加入10mmol/L
的EDTA螯合Mg2+ 。(3) 99-100℃加熱10min.目前已有直接純化PCR 產物的Kit 可用。
6.
反應緩沖液：反應緩沖液一般含10-50mmol/L Tris?Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L
KCl和適當濃度的Mg2+ . Tris?Cl 在20℃時pH 為8.3-8.8,但在實際PCR 反應中,pH 為6.8-7.8.
50mmol/L的KCl 有利于引物的退火.另外,反應液可加入5mmol/L 的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml
的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩定酶活性,另外加入T4 噬菌體的基因32 蛋白則對擴增較長的DNA 片段有利.各種Taq DNA
聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。
二、PCR 反應參數
1. 變性：在第一輪循環前,在94℃下變性5-10min
非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈,然后加入Taq DNA 聚合酶(hot
start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性,減少DNA產量.一般變性溫度與時間為94℃
1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC
的序列,可適當提高變性溫度.但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。
2.
退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm
值約低5℃。一般當引物中GC 含量高,長度長并與模板完全配對時, 應提高退火溫度。退火溫度越高,
所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環,
既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃-55℃,1-2min。
3.
延伸：延伸反應通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應溫度75℃.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA
聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應體系中,Taq DNA
聚合酶每分鐘約可合成2kb 長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列,
則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物,
這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。
4. 循環次數： 當其它參數確定之后, 循環次數主要取決于DNA
濃度。一般而言25-30 輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR 產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30 輪循環擴增后, 反應中Taq
DNA 聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增, 可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105 倍作為模板,
重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60 輪循環后, 擴增水平可達109-1010
。擴增產物的量還與擴增效率有關,擴增產物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C 為擴增產物量,C0 為起始DNA 量, P
為增效率, n
為循環次數。在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，
減少非特異性產物。
三、PCR 產物的克隆
在許多研究中,需要將PCR 產物克隆,以獲得目的DNA 片段。此時,所用PCR 循環數應盡量小,以減少平臺效應或非特異性擴增產物的干擾。通常將PCR 產物插入到載體中有下列一些方法。
1. 平末端連接：由于Taq DNA 聚合酶往往在PCR 產物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR 產物前,可用Klenow 片段或T4 DNA 聚合酶處理補平末端。
2.
在PCR 產物尾部加dT 或ddT：Taq DNA 聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A 優先聚合,所以PCR
產物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點,可以經限制酶切割產生的平末端用酶加上dT 或ddT,使載體與PCR
產物末端互補并進行連接.載體末端加dT 尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP 或ddTTP,ddTTP 因缺少3-OH
而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團可與PCR 產物的3'端OH 連接,連接產物在載體和PCR
產物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA 仍可轉化合適的受體菌,并在細菌體內修復.目前一些公司已開發出可直接用于克隆PCR 產物的帶3'-T
的T-Vector。
3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點,直接將PCR 產物經適當的限制酶切割后產生粘性末端,與載體連接,產生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點.經酶切后定向克隆到載體中。
第二節材料、設備及試劑
一、材料
不同來源的模板DNA。
二、設備
移液器及吸頭，硅烷化的PCR 小管，DNA 擴增儀(PE 公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機。
三、試劑：
1、10×PCR 反應緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris?Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ TritonX-100。
2、MgCl2 ：25mmol/L。
3、4 種dNTP 混合物:每種2.5mmol/L。
4、Taq DNA 聚合酶5U/μl。
5、T4 DNA 連接酶及連接緩沖液：配方見第五章。
6、經SmaⅠ酶切和加dT 的pUC 質粒。
7、其它試劑：礦物油（石蠟油），1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70％ 乙醇。
第三節操作步驟
一、PCR 反應
1. 依次混勻下列試劑
35μl H2 O
5μl 10×PCR 反應緩沖液
4μl 25mmol/L MgCl2
4μl 4 種dNTP
0.5μl 上游引物（引物１）
0.5μl 下游引物（引物２）
0.5μl 模板DNA(約1ng)
混勻后離心5 秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5 分鐘后冰冷,迅速離心數秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5μl 約2.5U），混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
3. 用94℃變性1 分鐘，45℃退火1 分鐘, 72℃延伸2 分鐘, 循環35 輪,進行PCR。最后一輪循環結束后, 于72℃下保溫10 分鐘，使反應產物擴增充分。
二、電泳
按第二章所述,取10μl 擴增產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產物及長度。
三、PCR 產物的純化
擴增的PCR 產物如利用T-Vector 進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。
（一）酚/氯仿法
1.取反應產物加100μl TE.。
2.加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000rpm離心15 秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中.這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。
3.再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。
4.在水相中加300μl 95％乙醇,置-20℃下30min 沉淀。
5.在小離心機上10000rpm 離心10min,吸凈上清液。加入1ml 70％乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復洗滌沉淀2 次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。
（二）Wizard PCR DNA 純化系統
Wizard PCR DNA 純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR 擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。該系統中含有的試劑和柱子可供50 次PCR 產物的純化，試劑包括：
50ml Wizard PCR DNA 純化樹脂
5ml 直接提取緩沖液
50 支Wizard 微型柱
1、吸取PCR 反應液水相放于1.5ml eppendorf 管中。
2、加100ml 直接提取緩沖液，渦旋混勻。
3、加1ml PCR DNA 純化樹脂，1 分鐘內渦旋混合3 次。
4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard 微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進入微型柱。
5、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 80%異丙醇，對微型柱進行清洗。
6、取出微型柱置于eppendorf 管中,12000g 離心20 秒，以除去微型柱中的洗液。
7、將微型柱放在一個新eppendorf 管中，加50μl TE 或水，靜止1 分鐘后，12000g 離心20 秒。
8、丟棄微型柱，eppendorf 管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
[注意] 1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。
2、PCR 產物中礦物油應盡量吸去，否則會影響提取DNA 的產量。
四、載體加dT 尾
1.將1μg pUC19 用SmaⅠ全酶切。
2.在小管中按上述PCR 反應,加入各種混合物,除將4μl 4 種dNTP 改為4μl 25mM dTTP。
3.加入1μl(5U)的Taq DNA 聚合酶在72℃下加熱2h。
4.按前面三中所述,用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。
5.加入2 倍體積95％乙醇,在-20℃下沉淀1hr。
6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O 中。
五、PCR 產物與載體粘末端連接
1、在7ml PCR 產物中加1ml 帶dT 尾的pUC 質粒。
2、加1ml T4DNA 連接酶，1ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過夜。
3、取5ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。
六、PCR 產物3'突出端切平及平末端連接
1. 在50ml 的PCR 產物中,直接加0.5ml T4 DNA 聚合酶混勻。
2. 37℃反應10 分鐘后,70℃滅活10 分鐘。
3. 用酚:氯仿抽提2 次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O 中。
5. 質粒用Smal 切開后，70℃ 15 分鐘滅活酶，取1ml （約0.1mg）加入上述PCR 產物中。加T4 DNA 連接酶1ml ，連接緩沖液1ml 。
6. 取5ml 連接產物轉化感受態細胞并篩選重組子。
[注意]1.PCR 非常靈敏, 操作應盡可能在無菌操作臺中進行。
2.吸頭、離心管應高壓滅菌, 每次吸頭用畢應更換, 不要互相污染試劑。
3.加試劑前, 應短促離心10 秒鐘, 然后再打開管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。
4.應設含除模板DNA 所有其它成分的負對照。
思考題
1.降低退火溫度對反應有何影響？
2.延長變性時間對反應有何影響？
3.循環次數是否越多越好？為何？
4.如果出現非特異性帶,可能有哪些原因？