一、材料
提純TMV 病毒液（10mg/ml）。
二、設備
冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。
三、試劑
TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液，無RNA 酶的雙菌水。
四、操作步驟
1、取一eppendorf 管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1 分鐘，4℃下12000g 離心10 分鐘。
2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。
3、吸取水相于新eppendorf 心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12000g 離心10 分鐘。
4、取水相，加入1/10 倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
5、4℃下12000g 離心15 分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g 離心5分鐘。
6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5 分鐘或空氣干燥10 分鐘，并溶于無RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
7、取10ml 進行電泳分析，另10ml 用于cDNA 合成。
[注意] 1、整個操作應盡可能在低溫下進行。
2、由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。
第四節cDNA 合成技術
一、Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技術
Promega
公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系統采用M-MLV 反轉錄酶的RNase H 缺失突變株取代AMV
反轉錄酶,使合成的cDNA 更長。該系統的第一鏈合成使用M-MLV 反轉錄酶,cDNA 第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH 和DNA
聚合酶Ⅰ進行置換合成,最后用T4 DNA 聚合酶切去單鏈末端,方法簡便易行。該系統試劑包括：
20μg 特異性引物
200μl M-MLV 第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃時); 375mmol/l KCl;
15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各2.5mmol/L)
2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制劑
10,000μ M-MLV 反轉錄酶, RNase H-5μg 對照RNA
400μl M-MLV 第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
500μ RNase H
500μ DNA 聚合酶Ⅰ
100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ
2×1.25ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。
（一） 第一鏈合成
1. 試劑
[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE 緩沖液。
2. 操作步驟
(1)
取一滅菌的無RNA 酶的eppendorf 管,加入RNA 模板和適當引物,每μg RNA 使用0.5μg
引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O 調整體積至15μl, 70℃處理5
分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入5×第一鏈緩沖液5μlrRNasin RNA 酶抑制劑25UM-MLV(H-
)反轉錄酶200UH2 O 調至總體積25μl
(2) 用手指輕彈管壁,吸取5μl 至另一eppendorf 管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),
用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
(3) 37℃(隨機引物)或42℃(其它引物)溫浴1 小時
(4) 取出置于冰上
(5) 摻入測定的eppendorf 管加入95μl 50mM EDTA 終止反應,并使總體積為100μl。可取90μl 進行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl 進行同位素摻入放射性活性測定。第一鏈合成eppendorf 管可直接用于第二鏈合成
注：以上25μl 反應總體積中所用RNA 量為1μg,如合成5μg RNA,則可按比例擴大反應體積, 倒5μg RNA 使用125μl 總體積進行合成。
（二） 第二鏈合成
1、取第一鏈反應液20μl, 再依次加入10×第二鏈緩沖液20μ lDNA 聚合酶Ⅰ 23μ RNase H 0.8μH2O 加至終體積為100μl
2、輕輕混勻,如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定,可取出10μl 至另一eppendorf 管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃溫浴2 小時(如需合成長于3kb 的cDNA, 則需延長至3-4 小時)。
4、摻入測定eppendorf 管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl 進行同位素摻入放射性測定,余下的可進行電泳分析。
5、cDNA 第二鏈合成離心管反應液70℃處理10 分鐘, 低速離心后置冰上。
6、加入2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃溫浴10 分鐘。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA 終止反應。
8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA 反應液,離心2 分鐘。
9、水相移至另一eppendorf 管,加入0.5 倍體積的7.5M 醋酸銨(或0.1 倍體積的1.5M 醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5 倍體積的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30 分鐘后離心5 分鐘。
10、小心丟去上清液,加入0.5ml 冰冷的70%乙醇,離心2 分鐘。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于10-20μl TE 緩沖液。
（三）同位素摻入放射性活性測定、計算和電泳分析
1. 試劑
1mg/ml 鮭魚精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mMNaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍）。
2. 操作步驟
(1) 各取一2(5)中和二(4)反應液各3μl,點于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。
(2) 同樣各取3μl 中反應液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚精DNA 中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30 分鐘。
(3) 用玻璃纖維濾紙過濾,用冰冷的5% TCA 洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml 丙酮或乙醇漂洗,這些樣品代表摻入放射性活性。
(4) 分別測定總放射性活性強度和摻入放射性活性強度,可用蓋革計算器,也可用液閃計數。
3. 第一鏈產量測定
第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%
摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應體積(μl)×(第一鏈摻入率)
設330 為每mol dNTP 的平均分子量
合成cDNA 量(ng)=摻入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA 向cDNA 轉變率=合成cDNA 量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%
例如總放射性活性強度為254,000cpm, 摻入放射性活性強度為3040cpm, 所用RNA 摸板量為1μg,反應體積為25μl, 則:
摻入率＝3040/254000×100%=1.2
摻入dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA 向cDNA 轉變率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于摻入測定,而反應體積占總體積80%,因而實際第一鏈cDNA 合成量為0.8×198ng=158ng。
4. 第二鏈產量計算
除需去除第一鏈摻入dNTP 外,方法同第一鏈產量計算
第二鏈摻入率= 摻入放射性活性/ 總放射性活性??
摻入dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反應體積(μl)－第一鏈摻入nmol]×第二鏈摻入率
第二鏈cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
雙鏈cDNA 轉變率=雙鏈cDNA 合成量(ng)/ 單鏈cDNA 合成量(ng)
例: 第二鏈摻入放射性活性強度為2780cmp, 總放射性活性強度為235000cpm.
第二鏈摻入率=2780/235000×100%=1.18%
第二鏈合成dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二鏈cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
雙鏈cDNA 轉變率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA 第一鏈轉變率和雙鏈轉變率以12-50%和50-200%為好。