（四） 電泳分析
通常合成的cDNA 第一鏈和第二鏈長度為350-6000 堿基,需進行1.4%堿性瓊脂糖電泳。將第一鏈和第二鏈摻入測定管中的反應液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法見本章（二）第二鏈合成中的9-12 步，一般第一鏈和第二鏈上樣量相同。
1. 標準分子量DNA 參照物的同位素標記
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA 聚合酶進行32 P 標記
10×HindⅢ緩沖液2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ標準DNA 1μg
Klenow DNA 聚合酶1μ
加H2O 到總體積25μl
(2) 室溫放置10 分鐘, 加2.5μl 200mM EDTA 終止反應, 加入2×樣品緩沖液,貯存于-20℃。
2. 電泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA 制備1.4%的堿性瓊脂糖電泳, 并置堿性電泳緩沖液中30 分鐘。
(2) 取樣品液, 用TE 調整體積, 使第一鏈和第二鏈產率測定液的體積相同,加入等體積的2×樣品緩沖液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉蘭）。
(3) 加樣,電泳到染料距前沿線只剩膠長度的1/3 處，電泳緩沖液為30mmol/L NaOH, 1mmol/LEDTA。
(4) 將膠浸入7% TCA 中,室溫放置30 分鐘(直至染料由藍色變至黃色),取出置濾紙上,干燥數小時。
(5) 用保鮮膜包裹干燥的膠,室溫壓X 光片(用增感屏時-70℃壓片)。
二、其它cDNA 合成技術
除Riboclone
M-MLV(H-)cDNA 合成技術外，Promega 公司還提供有多個AMV
合成試劑盒，不同試劑盒所提供的引物或引物一延接頭(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15
引物、隨機引物、XbaⅠ引物-延接頭、NotⅠ引物-延接頭等，其余試劑一樣，這些系統包括：
20mg 引物
20ml 5×第一鏈緩沖液, 配方如下：
250mmol/L Tris?Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
MgCl2; 2.5mmol/L 亞精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM 焦碳酸鈉
625m rRNasin RNA 酶抑制劑
600m AMV 反轉錄酶
5mg 1.2kb 對照RNA
200ml 10×第二鏈緩沖液，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
2m E.Coli RNaseH
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有試劑除對照RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。
（一）第一鏈合成
下面介紹的是25ml
體積反應系統，該系統可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反應體積10ml，如5mg mRNA 需55ml
反應體積。引物或引物-延接頭和反轉錄酶與mRNA 的比例應分別保持為0.5mg/mg（對NotⅠ引物-延接頭
為0.3mg/mg）和15m/mg.
1、試劑：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM 和200mM)，TE 飽和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE 緩沖液(10mM Tris?Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
2、操作步驟：
（1）取一滅菌的無RNA
酶的eppendorf 管加入的RNA 樣品，及引物或引物-延接頭，用H2O 調節0.5mg 引物/mg mRNA（或0.3mg
NotⅠ引物-延接頭/mg mRNA）的體積至15ml，70℃加熱5 分鐘，待冷至室溫，離心數秒鐘使溶液集中在管底，然后依次加入：
5×第一鏈緩沖液5mlrRNasinR RNA 酶抑制劑25ml
40mM 焦碳酸鈉2.5ml
AMV 反轉錄酶15m/mg RNA
加無水RNA 酶水至總體積25ml
在加入焦碳酸鈉和AMV 反轉錄酶前，需將反應液42℃溫浴5 分鐘，以阻止焦碳酸鈉沉淀。焦碳酸鈉主要用于抑止第一鏈形成發夾結構。
（2）輕彈eppendorf 管，取出5ml 至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其體積不能超過1ml），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
（3）42℃溫浴1 小時。
（4）取出置冰上。
（5）摻入測定的eppendorf 管加入50mM EDTA，終止反應，并使總體積為100ml。可取90ml進行電泳分析，另10ml 進行同位素摻入測定。
（6）第一鏈合成離心管可直接用于第二鏈合成
（二）第二鏈合成
第二鏈合成可在第一鏈合成反應液中直接進行。
1、第一鏈反應液（20ml）中依次加入
10X 第二鏈緩沖液10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m
加無核酸酶水至總體積100ml
余下步驟同本章第四節一（二）2-12 步及（三）和（四）。
思考題:
1. 為什么mRNA 提取是cDNA 合成成敗的關鍵？
2. 試比較自導引導法和置換合成法合成cDNA 的優缺點。