凝膠遷移率變動分析實驗

丙烯酰胺雙丙烯酰胺過硫酸銨TEMED(NNN'N'四甲基乙二胺）甘油 (50%;v v)競爭 DNA遷移率變動分析探針TBE凝膠遷移率變動分析緩沖液TE

材料

丙烯酰胺

雙丙烯酰胺

過硫酸銨（10%;w/v)

TEMED(N,N,N',N', 四甲基乙二胺）

甘油 (50%;v/v)

競爭 DNA(溶于 TE)(競爭 DNA 的種類和用量可隨蛋白質種類和純度的不同而異;親和層析純化的蛋白質不用競爭 DNA)

遷移率變動分析探針 (由互補寡核苷酸經 T4 多核苷酸酶和 [γ-³²P]ATP 的磷酸化后制成）

試劑

TBE(10X)

凝膠遷移率變動分析緩沖液 (10x)

TE

(配方，見"試劑的配制"，pp.131~138)

操作程序

1) 按下列配方制備一塊 5% 聚丙烯酰胺凝膠 (20 cmx20 cmx1.5 mm):

丙烯酰胺 (30%;w/v)/雙丙烯酰胺 (0.8%;w/v)                 16.2 ml

TBE(1x)                                                                          5.0 ml

H₂0                                                                               78.8 ml

混合，0.45um 濾膜過濾，然后加入 600ul10%(w/v) 過硫酸銨和 48ulTEMED。

2) 凝膠聚合 30~60 min, 上樣前用 100V 電壓預電泳 30 min。

3) 對每個樣品，均將下列成分混合于一置冰上的反應管：

遷移率變動分析緩沖液 (10x)                                            1ul

甘油 (50%;v/v)                                                                   2ul

競爭 DNA(需要時加; 對于純的蛋白質，可加 1ulH₂0 代替)1ul

蛋白質組分 (溶于含 0.1mol/LKCl 的緩沖液 Z 中)               5ul

遷移率變動分析探針 (~20000cpm/ul)                               1ul

總體積：10ul

輕彈反應管使溫和混合。

4) 樣品在室溫下孵育 10~15 min

5) 樣品直接加樣上膠。因染料常常會抑制蛋白質與 DNA 的結合，故建議不要在樣品中加染料。

6) 室溫下，以 100V 電壓電泳，直至作為參照染料溴酚藍 (點在膠板上不含蛋白質的泳道上) 遷移至膠板下方約 10 cm 止。

7) 膠干燥后進行放射自顯影 (一般，-80°C 數小時或過夜）。