冷凍飲品中大腸埃希氏菌O157的檢測

夏天到了，全國各地又進入了“燒烤模式”。4 月 23 日，廣州入夏；5 月 14 日，北京入夏；5 月 29 日，上海入夏。下圖為中國氣象網 8 月 3 日發布的一張高溫區域圖，紅色代表的高溫區域占據相當大的比例。

在炎炎夏日中，美味而且清涼的冷飲，可以讓大家忘卻酷暑炎熱。市場上各種品牌的冰淇淋、冰棒、汽水、果汁等產品琳瑯滿目，極大地豐富了人民的物質生活。但是冷飲的保存需要注意，通常都需要 4℃ 冷藏保存，部分冰品還需要 -20℃ 低溫保存。這些冷飲一旦融化后再復凍，里面就有可能會有細菌繁殖。

中國國家標準《GB 2759.1-2003 冷凍飲品衛生標準》對微生物含量做出了具體要求，下表為具體信息：

大腸埃希氏菌（E. coli）通常被稱為大腸桿菌，這些細菌常寄居在人和動物的消化道，并隨糞便排出體外，廣泛分布在水和土壤中。大多數腸道桿菌屬于正常菌群，當機體免疫力降低或侵入腸道外組織時，成為條件致病菌而引起疾病。腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以 O157:H7 血清型為代表菌株。根據相關標準，大腸埃希氏菌 O157 在冷凍飲品中不得檢出。

根據相應標準，RephiLe 特別推薦下面的冷凍飲品中大腸埃希氏菌 O157 檢測解決方案。檢測方案按照國際標準在固體培養基表面分離得到的典型菌落，該菌落能產品吲哚反應以及使 O157 血清產生凝集：

一、儀器

干熱滅菌箱和濕熱滅菌器；培養箱；PH 計；無菌接種環；移液器；磁性架；旋轉混合器；Direct-Pure UP 超純水系統。

二、試劑

增菌液：mTSB + N（改良胰蛋白胨大豆肉湯 mTSB + 新生霉素溶液）；CT-SMAC培養基；營養瓊脂；胰蛋白胨培養基；吲哚反應培養基；抗大腸埃希氏菌 O157 免疫磁珠；改良蛋白胨緩沖液，0.01 mol/L，PH 7.2；生理鹽水；Kovac's 靛基質試劑；大腸埃希氏菌 O157 抗血清。

三、實驗方法

1、取樣

取 (x) g 或是 (x) mL 樣品加入 9(x) g 或是 9(x) mL mTSB + N 增菌液中，于41.5℃培養，最后的樣品與 mTSB + N 體積比為 1:10。

2、增菌

將上述增菌液于 41.5℃ 培養 6 h，隨后再培養 12 - 18 h，總計培養 18 - 24 h。6 h 培養后進行隨后的免疫技術分離以及選擇性培養基上接種得到的假陽性結果在 18 h 培養后可能得到的是陰性結果。

3、免疫磁珠分離(IMS)

混合增菌液，將食物的殘渣棄去。

取一個離心管，加入 20 μL 已準備好的平衡到室溫的免疫磁珠微粒。取 1 mL 增菌液的上清液，避免吸入實物雜質或是脂肪加入到離心管中。在旋轉混合器上以 12 - 20 r/min 的速率將混懸液混合 10 min。

把離心管放置在磁性架上，將磁珠聚集起來，確保避免磁珠微粒吸附在管壁上。打開管蓋（離心管保持在磁性架上），使用無菌巴斯德吸管把液體從管子的底部慢慢吸起來，每個樣品均使用一個新的吸管。加入 1 mL 無菌緩沖清洗液蓋上管蓋，將離心管從磁性架上取下，正反顛倒混勻后放回磁性架。

重復上述清洗過程數次。

最后加入 100 μL 無菌緩沖清洗液使磁珠重新懸浮，然后從磁性架上取下。

4、接種

吸取 50 μL 懸浮液接種到預先干燥的 CT-SMAC 上，使用無菌接種環劃線以得到分離良好的單菌落。

37℃ 培養 18 - 24 h。

在 CT-SMAC 平板上，典型菌落形態為透明或是接近無色，菌落周圍出現黃棕色，菌落直徑為 1 mm。

5、確診

5.1 選擇菌落

每塊平板上選擇 5 個典型菌落，如果典型菌落少于 5 個則全部選擇。將典型菌落在營養瓊脂上分離純化。37℃ 培養 18 - 24 h。需選用純菌落進行鑒定。

5.2 生化鑒定：吲哚反應

挑取一個純化的單菌落于胰蛋白胨培養基中。37℃ 培養 24 h。加入 1 mL Kovac's 靛基質試劑，室溫下放置 10 min。出現紅色環為陽性反應，出現黃色環為陰性反應。

5.3 血清確診

只有吲哚反應陽性的菌落需要進行大腸埃希氏菌 O157 血清反應。

滴一滴生理鹽水在一塊干凈的玻片上，用接種環在營養瓊脂上挑取一個菌落于生理鹽水上，使菌落在生理鹽水里均勻分散，晃動玻片 30 - 60 s，在黑色背景下進行觀察。如果菌懸液形成塊狀，則該菌株是自動凝集菌株，不能進行特定抗血清的測試。

挑取營養瓊脂上的純菌落在玻片上，懸浮于生理鹽水中，滴加一滴大腸埃希氏菌 O157 抗血清。如果在 1 min 內出現凝集，則該反應為陽性。

菌落為吲哚陽性，并滿足 O157 抗血清或是 O157：H7 抗血清陽性。菌落即可鑒定為大腸埃希氏菌 O157。

6、質量控制

6.1 質量控制菌株

從國家菌種保藏中心可以得到不具毒性的大腸埃希氏菌 O157 菌株，該菌株可以用于培養基和血清的質量控制。

6.2 培養方法

為了測試實驗室能力以及按照該國際標準描述的測試方法測試培養基對于低含量的大腸埃希氏菌 O157 的檢出能力，準備一個低濃度不含致病性的大腸埃希氏菌 O157 參考樣品和一個添加大量其他大腸埃希氏菌的樣品進行平行測試。

7、檢出限與報告限

按照結果解釋，在指定的質量或是體積樣品中，根據本方法檢出或是未檢出大腸埃希氏菌 O157。

在包括大腸埃希氏菌 O157 在內的致病菌檢測及菌落總數檢測實驗中，培養基配制、試劑配制等步驟需要用到純水。RephiLe 特別推薦 Direct-Pure UP 一體化超純水系統。Direct-Pure UP 是一款以自來水為進水，同時生產 RO 純水和超純水的超純水系統。Direct-Pure UP 生產的超純水經雙波長紫外燈殺菌并分解有機物、0.22 μm 終端濾器截留后，超純水中細菌含量小于 1 cfu/mL，可以用來配制培養基和試劑溶液；RO 純水可以用來清洗實驗器皿及水浴。Direct-Pure UP 可以選配取水手柄，RephiLe 獨有ZL的取水內置電阻率檢測儀，可以實時反映取水點的真實水質；手柄連線長達 3 米，遠程取水輕松自由，方便舒適。RephiLe 還可以提供純水系統的驗證服務，幫助用戶完成符合 ISO、GMP、GLP 的系統驗證，滿足實驗室對于相關認證活動的要求。確保您在使用中安心，放心，用水無憂。