冠狀病毒及其離心分離

一、冠狀病毒概述：

冠狀病毒是引起感冒的主要病原，它只感染脊椎動物，可引起人與動物的呼吸道、消化道與神經系統病患。冠狀病毒的代表株早已被科學家查明，典型的如B814(1965,Tyrrell),229E(1996, Hamre),OC 43(1967,Melntosh)等等，此后，Almeida對冠狀病毒時完整形態進行了研究發現在它的脂質膜的外表面分布著類似日冕形狀的纖突，故命名為冠狀病毒。我國在1975年正式命名。目前流行的非典肺炎的病源，根據已完成的病毒基因圖譜排列（E.S.M.N蛋白，多聚酶及3CL蛋白水解酶和核苷酸序列）表明它是新發現的變異冠狀病毒，可能是動物傳給人類的。冠狀病毒和其他危害人類的病毒一樣，只有當它同細胞（或細菌）結合時才能獲得一些生命系統的特征。通常它是以微小的傳染顆粒的形式（病毒粒子）在細胞內傳播。他的化學組成主要是核酸和蛋白質。幾何尺寸為100~200nm，沉降系數700S~800S，在蔗糖液中的浮密度約為1.15~1.19。可以用電子顯微鏡來觀察它的顆粒的完整形狀和尺寸，進一步還可以觀察到他的內部結構。

冠狀病毒外形通常為近似球形。核酸位于中心部。最外部為纖突，是血凝素和神經胺酸酶的蛋白大分子，他附著在具有保護作用的脂質膜上。纖突是在病毒侵害人體細胞時附著到細胞上的吸附器。同時也是中和抗體的抗原。脂質膜往內依次是膜蛋白層。螺旋殼膜子粒、核酸鏈。

冠狀病毒的核酸為雙股線型RNA，同種冠狀病毒的核酸序列是恒定的，但是病毒發生變異后其核酸與蛋白的序列也會發生某些微小的變化。

冠狀病毒的生命周期中可見二個階段交替存在：即細胞外階級和細胞內階級。細胞外階級是以病毒粒子的狀態存在，即線型核酸外包著蛋白質殼膜；細胞內階級是以RNA形式存在，即當病毒核酸進入人體寄主細胞后，將引起病毒核酸的復制和特異病毒蛋白的合成。特異病毒蛋白包括組成病毒的殼膜和子粒的合成。由于冠狀病毒的核酸是RNA，所以它既可以直接作為m RNA也可以轉錄形成一個互補的RNA股。冠狀病毒進入人體寄主細胞后其信息通過人體細胞生物合成機構提供產能系統、核蛋白體、氨基酸活化酶、t RNA和其他組分來指導合成一系列的冠狀病毒蛋白，其中重要的有病毒核酸復制所需要的酶及病毒殼膜內的子粒。再進一步，冠狀病毒核酸自身作為復制的模板在特異聚合酶的作用下復制，并用上述由病毒核酸指導合成的病毒蛋白集裝成殼膜包圍成一個新的冠狀病毒顆粒，從而進一步破壞人體的組織。

二、病毒的分離純化：

i.取感染組織制成勻漿，普通低溫離心機3000rpm x 20分，棄去沉淀。

ii.取上清液少許滴在裝有火棉膠膜的銅網上，濾紙吸干后吹干，浸在2%醋酸鈾中染色，然后在透射電鏡中初步觀測，確認是否有病毒存在，如有，上清液作進一步離心分離。

iii.清液作等密度離心分離，日立P40ST或其它品牌類似甩平轉頭，6 x 13ml，用薄壁PA管，12ml  10~50%蔗糖（分析純）連續線性梯度，蔗糖梯度液表面鋪上清液至距離心管口3mm，33000rpm  1小時，5℃。病毒應沉降在36%蔗糖梯度附近。離心完畢后取出離心管靜置于試管架內，用上取法[日立DGF-U 密度梯度制備及片斷收集儀（本身帶管道泵）]，梯度儀泵出口連接到帶流動池的分光光度計，連續測定離心管中從上至下各層次的吸光度（波長280nm~340nm需試驗，優化）用記錄儀或打印機繪出分層容量——吸光度曲線，病毒的峰顯而易見。經過分光光度計的流動池后，每個離心管分部收集成50~100管，根據吸光度曲線中病毒峰位置可知病毒分布在哪（幾）個離心管中，透析去蔗糖，可得到純病毒樣品。

iv.參照“生物大分子加密度梯度離心”用等密度離心法或速率一區帶密度梯度離心法分離純化病毒的蛋白和RNA并可作進一步測序研究。