選擇一種特制的空質粒載體（如PBI121質粒載體），其上要求含有T-DNA邊界序列（此處可參見詞條雙元表達載體系統），在序列之間含有復制原點、抗性基因、GUS報告基因、Hind Ⅲ和BamH I 等酶切位點（以上這些構成了一個T-DNA區）。先通過雙酶切反應酶切空質粒載體和目的基因，再通過酶連反應連接空質粒載體和目的基因，從而構建成完整的重組質粒。此時重組質粒的T-DNA區包括T-DNA邊界序列、復制原點、突變啟動子片段、GUS報告基因、抗性基因。我們稱這段T-DNA區為目的片段。農桿菌轉化法的原理是構建雙元表達載體系統，由兩種質粒組成，一種是位于大腸桿菌中的穿梭質粒，另一種是位于農桿菌中的輔助性質粒。將重組質粒電轉化到農桿菌感受態細胞中后，用含有重組質粒的農桿菌去侵染植物根部切口，通過輔助性質粒的Vir區表達蛋白與重組質粒T-DNA區（目的片段）的反式作用激活T-DNA的轉移（此處可參見詞條雙元表達載體系統），從而將目的片段整合到植物細胞基因組中。隨著愈傷組織的形成，使得新生細胞均含有該目的片段的基因。