一、脈沖變角凝膠電泳—λ多聯體
1.以TE緩沖液懸浮λ多聯體(Boehringer MA寶靈曼公司產品),濃度為4μg/40μl。
2.用等體積TE配制的2%低熔點瓊脂糖(溫度保持在45℃)混勻。
3.移去混合液注入預冷的凝膠塊模具中。
4.室溫下用TE及100 mmol/L NaCl溶液溫育2天。
二、脈沖變角凝膠電泳—酵母染色體
1、從YPD(酵母提取物,蛋白胨和葡萄糖)培養基瓶皿中挑選單一克隆加入10mlYPD預培養的肉湯中,30℃下劇烈震蕩生長24小時,然后加入200ml YPD肉湯,劇烈振蕩24~48h(產量大約100塊)。
2、4000×g轉速,離心10min,然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液懸浮。
3、仍以4000×g轉速離心10min,再用SCE[1 mol/L 山梨醇,0.1mol/L枸椽酸鈉,pH5.8及10 mmol/LEDTA (pH7.5)]溶液重懸。
4、取稀釋后的細胞懸液用Neubauer腔計數。
5、溶液短暫離心后,再用SCE重懸細胞,使40μl SCE溶液中含5×107個細胞(相當于80μl體積的模塊中含有5×107個細胞)。
6、溶液與0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巰基乙醇混勻,37℃保溫15~30min。
7、細胞懸液與等體積的SCE配制的2%低熔點瓊脂糖凝膠混勻,保持在50℃。
8、將混合物移注入預冷的凝膠塊模具中。
9、凝膠塊用含10 mmol/L二硫蘇糖醇的SCE溶液37℃下振蕩溫育1~2小時。
10、將凝膠塊移入蛋白酶緩沖液中,加入2mg/ml蛋白酶K,50℃溫育48h。
11、用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗滌凝膠塊3次,每次20min。
12、凝膠塊可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接裝載入凝膠中。
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