專性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長。結核分枝桿菌細胞壁的脂質含量較高，影響營養物質的吸收，故生長緩慢。結核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和溫度為36℃±5℃，合適PH值為6.8~7.2的條件下生長旺盛。在一般培養基中每分裂1代需時18～24小時，營養豐富時只需5小時。
初次分離需要營養豐富的培養基。常用的有羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等。孔雀綠可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。根據接種菌多少，一般2～4周可見菌落生長。菌落呈顆粒、結節或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。在液體培養基中可能由于接觸營養面大，細菌生長較為迅速。一般1～2周即可生長。臨床標本檢查液體培養比固體培養的陽性率高數倍。