對多種β-內酰胺酶穩定,對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有顯著的抗菌活性。與第一、二代相比，其抗菌譜更廣，抗菌活性更強。特別對革蘭氏陰性桿菌的抗菌譜廣、抗菌作用強。有些品種對綠膿桿菌或脆弱擬桿菌亦有很好的抗菌作用。
它們除對痢疾桿菌、沙門氏桿菌有高度抗菌活性外，對大腸桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、產氣桿菌等均有顯著的抗菌作用。其抗菌活性均優于第一、二代頭孢菌素。它們對塞拉蒂氏菌也有很好的抗菌作用。第三代頭孢菌素對產酶和不產酶金葡菌一般是敏感或中敏。對金葡菌的抗菌活性雖不及第一、二代頭孢菌素為強，但仍屬有效范圍。它們對糞鏈球菌抗菌活性亦差。對腦膜炎球菌顯示了極為突出的抗菌活性。
第三代頭孢菌素按化學結構可分為三小類：
①酰胺型頭孢烯類。包括氨噻肟型和哌嗪型兩類。氨噻肟型頭孢菌素包括頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松和頭孢他啶等。由于有氨噻肟基,所以對β-內酰胺酶穩定。前四種抗菌譜廣，抗菌作用強，而頭孢他定由于有羧基，所以有較強抗綠膿桿菌作用，在頭孢菌素中，抗綠膿桿菌活性最強，其作用高于頭孢哌酮。頭孢三嗪是長效頭孢菌素。哌嗪型的頭孢哌酮抗菌譜廣，且具有抗綠膿桿菌作用,但對β-內酰胺酶的穩定性較氨噻肟型和甲氨基型弱。
②頭霉素類。包括頭孢米諾等，兼具抗厭氧和需氧的雙重特性，與第二代頭孢的頭孢美唑相比其抗革蘭氏陰性菌的作用更強、抗菌譜更廣，但對金葡菌的活性較低。
③氧頭霉素。亦屬頭霉素，拉他頭孢兼具抗厭氧和抗需氧菌的雙重廣譜作用，并對 β-內酰胺酶穩定，但有時有出血的不良反應，所以合成氟莫頭孢。與拉他頭孢相比，后者抗金葡菌的活性較低，而前者對各種細菌的活性都是高的，特別是對耐甲氧西林的金葡菌具有較高的活性。當然兩者抗綠膿桿菌的活性較低。