放線菌細胞壁的結構組成與革蘭陽性細菌相似，其主要成分為肽聚糖，既有N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁借助β-1,4糖苷鍵連接成鏈狀結構，再由胞壁酸上的短肽側鏈進一步交聯成為立體網格分子。除極個別的例外，放線菌的革蘭染色結果一般都為陽性。
在不同種類的放線菌中，短肽側鏈上的氨基酸組成略有差異，這些差異常用于對放線菌的分類及鑒定。可以根據細胞壁中的氨基酸組成不同將放線菌的細胞壁分為六種類型：Ⅰ型——含有甘氨酸和L-2,6-二氨及庚二酸和內消旋二氨及庚二酸；Ⅱ型——含有甘氨酸和內消旋二氨基庚二酸：Ⅲ型——只含有內消旋二氨基庚二酸 ：Ⅳ型——含有內消旋二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖：Ⅴ型——含有藍氨酸和鳥氨酸：Ⅵ型——含有賴氨酸和天門冬氨酸。
放線菌的細胞壁中還含有一些其他的糖類，如阿拉伯糖、半乳糖、木糖及馬杜拉糖等。