(一) 抗原和抗體濃度、比例
抗原和抗體濃度、比例對抗原抗體反應影響最大，是決定性因素，如前所述。
(二) 電解質
抗原與抗體特異性結合后，其親水性減弱，分子表面所帶的電荷易受電解質影響而失去，復合物間的排斥力下降，導致第一階段已形成的可溶性結合物能進一步聯結，出現明顯的凝集或沉淀現象。試驗中常用0.85%的NaCl溶液作為稀釋液，以提供適當濃度的電解質。
(三) 溫度
適當的溫度可增加抗原與抗體分子碰撞的機會，加速結合物體積的增大，一般而言溫度越高，形成可見反應的速度越快，但過高則會使抗原或抗體變性失活，影響試驗結果。一般在37℃下進行試驗，但也有些抗原抗體在4℃下進行反應較好。
(四) 酸堿度
pH過高或過低都將直接影響抗原或抗體的理化性質。例如，當pH降至3.0左右時，因接近細菌抗原的等電點，細菌表面蛋白或其他基團所帶的電荷消失，其相互間的排斥力喪失而導致非特異性酸凝集，影響試驗的可靠性。