一、實驗目的
對于一些按常規方法難以轉染甚至無法轉染的細胞,通過病毒介導的實驗能夠大大提高基因的轉導效率,以達到目的基因的高效瞬時表達。
二、實驗流程
1. 根據目的基因相關信息(序列,序列號等),構建含有外源基因或siRNA的重組載體;
2. 對于測序正確的重組質粒,提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒;
3. 使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T 細胞,進行病毒包裝和生產,收集病毒液;
4. 濃縮、純化病毒液;
5. 用高質量的病毒液感染細胞;
6. 通過定量PCR精確測定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western 分析實驗結果;
7. 用高質量的病毒液感染宿主細胞;檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩定轉染細胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。