八、使用說明
操作步驟(可直接在玻片上涂布)
1.滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。
2.用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內,使其溫度到室溫18-26℃
3.將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。
4.在60℃烘箱1小時干燥,或室溫18-26℃過夜干燥待用。
九、注意事項
1.每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張, 超過90張片子將影響其黏合力。
2.用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。
3.不要在用過的稀釋液中加新的溶液。
4.釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8℃,至少在3個月內是穩定的。
5.用過的稀釋液要過濾,若出現渾濁或長菌要丟棄。
十、將0.5%多聚賴氨酸溶液加入細胞培養皿中,浸泡5-10分鐘并自然晾干待用即可。
十一、多聚賴氨酸(poly-l-lysine):常用包被培養皿的基質之一.。
1.配制硼酸緩沖液(PH8.4)
A液:硼砂溶液--1.907g溶于100ml三蒸水(0.05M)
B液:硼酸溶液--1.237g溶于100ml三蒸水(0.2M)
4.5mlA液+5.5mlB液=硼酸緩沖液(PH8.4)
2.多聚賴氨酸5mg溶于50ml硼酸緩沖液中,配成100μg/ml的多聚賴氨酸溶液。過濾除菌,-20度保存。
3.使用時4倍稀釋,可以重復使用3次!
十二、聽說一般買來的多聚賴氨酸都是用了做免疫組化時用的,一般都加了防腐劑,不利于細胞培養。所以我以前都是自制鼠尾膠原。請教midas主任,不知道這種說法是否正確?
答:我不知道別的地方PLL的來源,不過我們這里是sigma的粉劑,而且注明是for cell culture。
如果多聚賴氨酸中有防腐劑那么肯定不適合細胞培養!
十三、一些參考書上有的用三蒸水,有的用PBS配置,這與你說的很有出入,是不是三種配法都可以?不知道那一種更合理些?
答:其實都可以,不過這是推薦的方法!(用硼酸緩沖液)
十四、主任,按照您的配方,多聚賴氨酸的使用濃度應該是0.025mg/ml,目前我們實驗室的使用濃度是0.1mg/ml,這個濃度來源于上海腦所.我想請問一下,我們用的濃度是否偏高,我培養的是大鼠星形膠質細胞,如果用您推薦的濃度,細胞是否容易貼壁.謝謝!
答:有些文獻上也是用的0.1mg/ml,但是我們在實際工作中用0.025mg/ml是完全可以的。
方法是至少包被4h以上,過夜也可以(可重復用3次)!之后無菌水清洗,晾干后即可使用。
用于配養細胞的多聚賴氨酸分子量要求>70,000,一般常見的分子量有70,000~150,000,150,000~300,000
和>300,000,分子量越大,黏附力越強,但相對完全溶解較困難,所以我推薦使用150,000~300,000比較好。
多聚賴氨酸的工作濃度各家文獻報道相差很大,從0.25 mg/ml到0.01mg/ml都有,因為多聚賴氨酸對細胞有毒性,所以在保證貼附的前提下,濃度越低越好,還省錢。我現在用的是0.01mg/ml。
多聚賴氨酸的配制濃度在各個書上不一,我也在做原位雜交,濃度是0.01mg/ml比較好吧
十五、請問多聚賴氨酸(150000——300000)如何配置?保存?工作濃度?
答:多聚賴氨酸應該是避光保存的.
我們實驗室使用的方法如下,希望對你有用:
多聚賴氨酸(Poly-L-Lycine,PLL)
試劑:多聚賴氧酸 5g
蒸餾水 1000ml
配制方法:稱取PLL,溶于H2O,充分混合即可,此液濃度為0.5%,可適當稀釋配成0.01~0.5%濃度。4℃保存,也可 -20℃備用。PLL可反復冰凍,效果無明顯影響,工作液常再稀釋10~50倍。
我的使用方法如下:
先配制成10mg/ml的濃縮液,使用前按照1:80稀釋,制成工作液,濃度25ug/ml,可用于包被培養皿。