（2）Chadwick氏法
試劑和材料：抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01 mol/L pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機及離心管、三角燒瓶(25 ml)、冰槽、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500 ml)透析袋、棉線、玻棒等。
方法及步驟：
①抗體準備：用0~4 ℃的pH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水將抗體蛋白溶液稀釋至濃度為30~40 mg/ml，置入三角燒瓶內，放于冰槽中。
②熒光素準備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01 mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。
③將準備的抗體與熒光素溶液等量混合，充分攪勻，在0~4 ℃冰箱中結合18~24 h。
④透析和柱層析：方法同Marshall氏法。
（3）改良法
試劑：
①0.01 mol/L pH7.2 PBS配法：NaCl 18 g、Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.2 g，溶于2000 ml蒸餾水中，校定pH至7.2。
②0.5 mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5 mol/L Na2CO3（5.3%）10 ml加入0.5 mol/L NaHCO3（4.2%）90 ml，混勻后，校定pH至9.0。
③3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
方法及步驟：取高效價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15 mol/L NaCI）及緩沖液（0.5 mol/L
NaHCO3-Na2CO3 pH 9.0）稀釋使每ml內含抗體10 mg，緩沖液為總量的10%，降溫至4
℃，加入異硫氰酸熒光素，(蛋白：熒光素=80 mg:1 mg)，在0~4 ℃下電磁攪拌12~14
h。然后用半飽和的硫酸銨將標記球蛋沉淀分離，除去未結合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler氏試劑測驗至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%，分裝在1
ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4 ℃）可以用半年以上，-20 ℃保存可達2年以上。
2、四甲基異硫氰酸羅達明標記抗體方法
（1）取IgG10 ml（6 mg/ml）在0.1 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。
（2）將四甲基異硫氰酸羅達明（每毫克IgG加入5~20 g）溶于二甲亞砜（1 mg/ml），取此溶液300 ml,一滴一滴加入抗體溶液中，同時電磁攪拌。
（3）在室溫中攪拌2 h，避光。
（4）把結合物移入直徑3 cm，高30 cm大小的Bio-Gel P-6層析柱，用0.01 mol/L pH 8.0的PBS平衡過柱，流速為1.5 ml/min。
（5）收集先流出的紅色結合物，即為標記抗體，分裝，4 ℃保存備用。
3．藻紅蛋白標記抗體方法
（1）巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin，PE）的制備600 μl的15.5 mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane
hydrochloride）加到1.2 ml的3.6 mg/ml的PE中，和1.2 ml PB（pH 6.8）混合，裝入透析袋置入50
mmol/L pH 6.8 PB中透析，4 ℃過夜，再換用pH7.5 PB透析6 h。每個PE分子中可結合8個巰基。
（2）巰基PE-IgG制備 異雙功能試劑SPDP[N-Succinimdyl 3-(2-pyridyldithio) propionate]
30 g（1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700 μl的4.2 mg/ml IgG PB溶液（50 mmol/L pH
7.5），在室溫中反應2.5 h。再加入巰基化PE400 μl（1.7 mg/ml）加到500 μl反應混合液中，室溫反應12 h，加入100
μl的50 mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，在4 ℃用PB透析過夜。加入0.01%NaN3分裝，4 ℃保存半年。
（3）PE-標記蛋白A方法
①取4.08 mg PE 溶于0.1 mol/L pH 7.4 PB（含0.1 mol/L NaCl）1 ml中，溶解后，取出0.5
ml，再加入10 μl SPDP無水甲醇液（2.6 mg/ml），SPDP/蛋白摩爾比為10，22 ℃反應5 min，過Sephadex
G-50（1×17 cm），用100 mmol/L pH 7.4 PBS（含0.1 mol/L NaCl）平衡和洗脫。
②0.5 ml蛋白（2 mg/ml）100 mmol/L PBS（含有100 mmol/L NaCl pH 7.4），加入2.6
μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白A=9：5 ，22 ℃，40 min，加入25 μl二硫蘇糖醇（DTT）pH 7.4緩沖液，22 ℃，25
min，同上過sephadex G-25，收集蛋白A峰。
③取0.77 mg/ml的PE和0.27 mg/ml蛋白A等量混合，22 ℃反應6 h，混合物4
℃保存備用，以上兩種PE標記制品，可最后溶于0.01 mol/L pH 7.4 PB（含有0.1 mol/L EDTA、1 mol/L
碘乙酰胺、1% BAS和0.1% NaN3），0~4 ℃保存。
4．藍色熒光素標記抗體方法
Kbaffan 等(1986)首先創立了藍色熒光素標記和染色技術，可進行雙標記或多標記。
（1）取7-氨基-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin，AMC）260 μg溶于二甲亞砜25 μl中。
（2）將上液加入10 ml IgG-巴比妥緩沖液（0.5 mol/L，pH 8.5，內含50~100 mg IgG）中，室溫反應2 h，過Sephadex G-50除去游離熒光素, 最大熒光波長430 nm，最大吸收波長354 nm。