免疫印跡法分三個階段進行.第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動，分子量越小，泳動速度就越快.此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區帶）.第二階段為電轉移：將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成.此階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見.第三階段為酶免疫定位：將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色.常用的HRP底物為3,3'-二氨基聯苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）.陽性反應的條帶清晰可辨，并可根據SDS-PAGE時加入的分子量標準，確定各組分的分子量.本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷.在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗.抗原經電泳轉移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒,可方便地在實驗室中供檢測用.根據出現顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體.