免疫印跡是一個用于蛋白質分析的常規技術,在電場的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉移至一種固相支持物,然后利用抗原-抗體的特異性反應,從蛋白混合物中檢測出目標蛋白,從而定量或定性的確定正常或實驗條件下細胞或組織中目標蛋白的表達情況。
Western blotting還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續分析,作為一種廉價、便捷、可靠的研究工具,將與質譜和蛋白質芯片等技術一起在蛋白質組時代發揮重要作用。
Western Blotting的protocol種類繁多,但大同小異,基本為上述幾個步驟。要得到一個完美的實驗結果,不僅需要優質的抗體,同時應對整個實驗流程和體系進行嚴格的質量控制,才能最終達到你的實驗目的。
影響免疫印跡成敗的一個主要因素是抗原分子中可被抗體識別的表位性質。
因為涉及到抗原樣品的變性,只有那些識別耐變性表位的抗體可以與抗原結合。多數多克隆抗體中或多或少含有這種類型的抗體,所以在免疫印跡中常選用多克隆抗體。第二個影響因素是蛋白原液中抗原的濃度。一些表達量低的蛋白在免疫印跡前常需要通過免疫沉淀,亞細胞分離等手段富集。
Western實驗步驟
一、樣品制備
對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。
當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常樣品有重組蛋白、細胞和組織等。
1. 樣品收集
1)培養的細胞
貼壁和懸浮細胞收集方式不同,細胞裂解液種類各異,推薦含SDS的凝膠加樣緩沖液裂解,煮沸即可。
2)動物組織
與細胞不同,組織塊由于體積較大,須預先經破碎勻漿處理。
2.樣品定量
樣品電泳前需測定蛋白濃度,以便保證上樣量一致,有利于后續定量或半定量分析。常用的蛋白質濃度測定方法有好多種,其靈敏度和所需時間不同,且不同的方法會受不同干擾物質的影響,實驗者可根據樣品制備方法(裂解液成分、去垢劑和還原劑種類等)自行選擇。
幾種蛋白質濃度測定方法比較
注意事項:
a. 應盡量避免引入影響后續定量的雜蛋白(如細胞培養液、蛋白酶抑制劑等)及其他干擾物質;
b. 樣品濃度應適中,1×SDS凝膠加樣緩沖液建議用量:貼壁細胞按10 cm2培養皿/0.1 ml,懸浮細胞按5×106細胞/0.1 ml比例加入;
c. SDS對蛋白質變性和電泳分離至關重要,濃度應控制在2-10% 之間,并根據具體需要調整;
d. 制備好的樣品可以在-20℃ 保存,但時間不宜過長,并避免反復凍融,否則蛋白會發生降解;
e. 內參對實驗結果至關重要,應選擇合適的內參。
二、電泳
電泳分為非變形凝膠電泳和變性凝膠電泳,Western Blotting中常用的是不連續緩沖系統下的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),該法中由于變性的多肽與SDS結合而帶負電荷,在凝膠電泳中遷移率僅與多肽的分子量相關。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑,而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數。
SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍
丙烯酰胺濃度(%) 線性分離范圍(KD)
15 12-43
10 16-68
7.5 36-94
5.0 57-212
注意事項:
a. 根據目標蛋白的分子量選擇合適濃度的凝膠,以達到最優的分離效果和分辨率;
b. 分離膠不宜灌注過滿,需要有一定的濃縮膠空間,否則起不到濃縮效果;
c. 各泳道上樣體積最好大體一致且適中,體積偏差過大會相互擠壓導致條帶走形,為避免邊緣效應,可在未加樣的泳道加入等量的樣品緩沖液;
d. 電泳時應保持電壓和電流穩定,且不宜過高,否則會造成不規則的蛋白質遷移帶;
e. 如有特殊需要,可以使用梯度膠,高濃度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白質形成清晰的條帶,還能在一塊膠內同時分離分子量范圍更大的蛋白質。
三、轉膜
蛋白質經SDS-PAGE分離后,必須及時從凝膠中轉移到固相支持物上,固相支持物能牢固結合蛋白又不影響其抗原活性,而且支持物本身還有免疫反應惰性,這使其比直接在凝膠上檢測更易操作,試劑用量更少,更省時,效果更好。
蛋白質從凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法,分為半干式和濕式轉印兩種模式,與SDS結合的蛋白由于帶有負電,在電場中向正極遷移,并最終結合在固相支持物上。兩種方法均卓有成效,且各有所長,實驗者可根據實驗情況不同進行選擇。
常用固相支持物
注意事項
a. 樣品屬性、膜類型、膠濃度以及轉移緩沖液均會影響蛋白質的轉移效率,比如小分子量蛋白與大分子量蛋白相比,遷移迅速,但結合不牢固;
b. 蛋白與固相支持物結合的程度受多種因素影響,如膜屬性(孔徑和類型),緩沖液屬性(pH 值、鹽離子種類、鹽濃度、去垢劑等),如實驗結果不佳,可分別進行優化;
c. 如果轉膜與電泳的緩沖液系統不同,轉膜前應將凝膠在轉膜緩沖液中平衡,防止凝膠膨脹或收縮,以保證條帶清晰完整;
d. 提高蛋白質轉移效率的方法:轉移緩沖液中加入甲醇或低濃度的SDS (0.02-0.1%),使用小孔徑膜,轉移后立即用戊二醛交聯;
e. 轉膜時間和電流大小可根據蛋白分子量大小靈活調整;
f. 轉移效果可通過染膠(考馬斯亮藍染色或銀染)或染膜(麗春紅 S 染色、印度墨汁染色)來鑒定。
四、封閉
在進行抗體雜交之前,需要采用異源性蛋白質先對轉印膜進行封閉,防止免疫試劑的非特異性吸附,從而降低背景,增加靈敏度,提高信噪比。常用封閉物有脫脂奶粉和 BSA(稀釋于不同的緩沖液中),但不同的抗原-抗體反應,封閉條件均不相同,沒有適合所有系統的封閉液,具體封閉條件(包括封閉液濃度、緩沖液種類、封閉時間、溫度等)需自行優化。
注意事項
a. 影響非特異性結合的因素很多,針對不同的免疫原,其封閉條件均可進行優化,沒有通用的封閉液,因為每個抗原-抗體反應都具有獨特的性質;
b. 在選擇封閉物時,最重要的標準是信噪比,封閉條件不足,會導致過多的背景噪音,封閉條件過度,會造成信號變弱;
c. 可根據不同的檢測系統(堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)、蛋白質屬性(分子量大小)選擇適當的封閉物及緩沖液(PBS 或 TBS)。
五、雜交
封閉后,目標蛋白便與特異性的一抗進行免疫反應,一抗可以是標記的,也可以是非標記的。標記的一抗與免疫原結合后,可直接進行檢測(直接法),降低了背景和非特異性結合,但信號較弱。
非標記的一抗配合標記的二抗使用(間接法),對信號有級聯放大作用,可以增加靈敏性和信噪比。二抗既可標記放射性同位素,也可標記染料或其他分子,或與酶偶聯。常用的酶包括堿性磷酸酶(AP)和辣根過氧化物酶(HRP),通過與底物反應產生光信號。
注意事項
a. 標記方法的選擇視靈敏度和易操作性而定,通常有四種標記系統:化學發光、放射性同位素、熒光、化學熒光;
b. 一般而言,一抗常用非標記的,但遇到特殊實驗需要,可以對一抗進行相應標記;
c. 單抗和多抗各有利弊,多抗便宜、制作省時、親和力高,但特異性不佳;單抗特異性好、純度高、重復性好,但制作工期長,價格較高;
d. 一抗稀釋比例及反應條件(溫度、時間)視抗體效價而定,并需根據實驗結果進行優化,二抗一般可固定一個反應條件(建議 1:4000、室溫 1 小時);
e. 清洗步驟對移除未結合試劑、降低背景、增加信噪比至關重要,清洗不夠會造成較高背景,清洗過度會導致靈敏度降低,清洗液的成分可適當調整。
六、顯色發光
根據二抗的標記物不同,其顯色方法也不同,并通過膠片或影像系統(CCD)收集。較常用的檢測系統有 HRP 標記二抗的增強化學發光(ECL)和 DAB 檢測系統。
注意事項
a. 根據不同的實驗目的和需要(定量、半定量)選擇不同的檢測系統;
b. 反應液應覆蓋均勻,尤其是邊緣部分;
c. 信號應盡快采集,防止時間過長,導致信號失真;
d. 信號強度應有一個由弱到強的梯度,以免結果信息遺失,區分度不大。