免疫共沉淀與WesternBlot

免疫共沉淀與Western Blot
實驗步驟:
1．以60mm 細胞培養皿為例，細胞轉染后24－36 小時后，吸凈培養液（可用PBS
小心漂洗一次）。
2．加入500μl 預冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解細胞5 分鐘。
3．將細胞裂解液轉移到1.5 ml eppondorf 管內，于冷凍離心機4℃，13000 g 離心30
分鐘。
4．將離心后的上清液分為兩份：一份35μl，加入等體積的2×SDS sample buffer, 混
勻后于100℃煮10 分鐘，做為總細胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃
保存，或取6－10 μl 進行SDS－PAGE 電泳，Western blot 檢測目的蛋白的表達
水平（接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具體操作如下：
1） 分A/G beads：按每管（一個免疫沉淀樣品）加入5 μl Agrose A/G beads
及5 μl（1 μg）抗體計算一次實驗所用beads 及抗體的總量，將抗體和beads 混
合，補充lysis buffer （補充的lysis buffer 的量能使每管能均勻分配到50 μl beads
及抗體的混合物），將beads 及抗體的混合物按每管50 μ（l 含5 μl beads 及5 μl 抗
體）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，備用；
2） 從步驟4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步驟
1））已分好的beads 中，使終體積達到850 μl，將管子固定到混勻器上使混勻器
勻速旋轉（15 rpm）免疫沉淀3 小時；
3） 將免疫沉淀后的溶液于4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘，去上清，加入500μl
1×lysis buffer 洗滌beads，于冷凍離心機4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘，棄上清，共
洗滌三次。
4）最后一次洗滌完畢，棄上清，管中只剩Beads，加入35 μl 1×lysis buffer 與
等體積2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分鐘，稍離心后取10μl 左右
上樣到PAGE 膠，進行電泳，或－20℃凍存。
5．電泳完畢，取下PAGE 膠，與PVDF 膜做成"三明治"形狀，用濕轉法進行電轉1
小時。
6．電轉完畢，取下PVDF 膜，加入5％脫脂奶粉，于脫色搖床搖蕩（75 rpm）封閉
1 小時以消除非特異背景。
7． 封閉完畢，用TBST 洗掉牛奶，加入一抗，于脫色搖床搖蕩孵育（75 rpm）1
小時，使一抗與特異蛋白結合。
8． 回收一抗，用TBST 洗3 次（75 rpm），每次5－10 分鐘。
9． 加入二抗，于脫色搖床孵育1 小時，使二抗與一抗結合。
10．用TBST 洗3 次，每次5－10 分鐘。
11．將ECL A 液和ECLB 液各1ml，混勻，放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒，將
PVDF 膜平鋪于曝光盒中，進暗房，用醫學X 光膠片曝光。
12．經過顯影、定影后的膠片，于室溫下自然風干或烘干，描畫蛋白marker 便于分
析。
注：如只做Western Blot，跳過步驟4 即可。
實驗試劑：
1．PBS：