玉米赤霉烯酮快速分析技術
1、簡述
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN),又稱 F2 毒素,是由禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、黃色鐮刀菌、串珠鐮刀菌、木賊鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等菌種產生的有毒代謝產物,是一種雌激素真菌毒素。化學名為6-(10-羥基-6-氧基-1-炭烯基)β-雷瑣酸-μ-內脂,是一種白色的結晶,分子式為 C18H22O5,相對分子質量為318;熔點為164～165℃;紫外線光譜最大吸收為236nm,274nm 和316nm;紅外線光譜最大吸收為970nm。純的玉米赤霉烯酮不溶于水、二硫化碳和四氯化碳,溶于堿性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇,微溶于石油醚(b.p.30～60℃),在紫外線照射下呈藍綠色。
玉米赤霉烯酮首先從赤霉病玉米中分離,有15種以上的衍生物,其主要存在于玉米和玉米制品中,小麥、大麥、高粱、大米中也有一定程度的分布,ZEN 主要污染玉米、麥類、谷物等。
玉米赤霉烯酮具有較強的生殖毒性和致畸作用,可引起動物發生雌激素亢進癥,導致動物不孕或流產,對家禽特別是豬、牛和羊的影響較大,給畜牧業帶來經濟損失。飼料中1mg/kg 的玉米赤霉烯酮就會使動物產生雌性化,更高的濃度(50～100mg/kg)將會對懷孕、排卵、移植、胎兒的發育、新生動物兒的生存力產生不利的影響。
目前玉米赤霉烯酮的測定方法有免疫親和柱熒光計法、薄層色譜法、氣相色譜法、高壓液相色譜法等。下面介紹的是免疫親和柱熒光計快速測定法。
2、免疫親和柱熒光計快速測定法
①試劑與設備
(1)4-系列真菌毒素專用熒光計。
(2)均質器(250mL)。
(3)微量移液器(1.0mL)。
(4)渦流混合器。
(5)玻璃纖微濾紙(1.0m)。
(6)VICAM 玉米赤霉烯酮親和柱。
(7)聚乙二醇(PEG),相對分子質量8000。
(8)色譜級甲醇。
(9)色譜級乙腈。
(10)氯化鈉。
(11)VICAM 玉米赤霉烯酮衍生液。
(12)VICAM 真菌毒素通用標定標準物。
(13)0.1%吐溫-20/PBS 緩沖液。
②標定值的設置:使用 VICAM 真菌毒素通用標定標準物
儀器 | 綠色 | 紅色 | 黃色 |
Vicam4 系列真菌毒素專用分析儀 | -0.05 | 0.45 | 0.20+/-0.03 |
③試驗準備
(1)標定熒光計。
(2)確認延時時間為300s。
(3)配制1倍0.1%吐溫-20/PBS緩沖液(每月配制一次,或根據需要配制)。
(4)配制提取液:乙腈/水(90:10,體積比),或者甲醇/水(80:20,體積比)。
(5)試劑空白試驗(1mL 甲醇+1mL 顯色劑置于測試管中),熒光計讀數應為0。
(6)空白試驗(2mL 純水置于測試管中),熒光計讀數應為0。
④樣品提取
(1)稱取20g 磨細的樣品,2g 氯化鈉,置于攪拌杯中。
(2)加入50mL 甲醇/水(80+20)溶液,或者乙腈/水(90+10)。
(3)蓋上攪拌杯的蓋子,高速攪拌2min。
(4)取下蓋子,將提取物倒入折疊式濾紙上,濾液收集于干凈的容器中。
⑤提取物的稀釋
(1)移取10mL 上步的濾液,置于干凈的容器中。
(2)用40mL 1倍0.1%吐溫-20/PBS 緩沖液稀釋,混勻。
(3)將上步稀釋液通過玻璃微纖維濾紙(1.0μm)過濾,濾液收集于玻璃注射器筒中量取10mL。
⑥分離柱色譜操作與測定
(1)將上步10mL 濾液(10mL 相當于0.8的樣品),以1～2滴/s 的流速全部通過 Zearala Test 親和柱,直至空氣進入到親和柱中。
(2)將10mL 0.1%吐溫-20/PBS 緩沖液以1～2滴/s的流速通過親和柱。
(3)將10mL 純水以2滴/s的流速通過親和柱,直至空氣進入到親和柱中。
(4)用1.00mL HPLC 級的甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱,將所有樣品淋洗液(1mL)收集于玻璃測試管中。
(5)將1.00mL ZearalaTest 顯色劑加到測試管的淋洗液中。混勻后,將測試管置于已標定好了的熒光計中。300s 后,讀數。
(6)檢測限:0.10mg/kg,測定范圍0～5.0mg/kg。