免疫親和柱熒光計快速分析法赭曲毒素是赭色曲霉屬和幾種青霉屬真菌產生的一種毒素,包括 A,B,C 等7種結構類似的化合物,其中以赭曲毒素 A 毒性最大。下表列出了世界各國對各種商品中赭曲毒素 A 存在情況的研究結果。
(1)儀器設備與試劑
真菌毒素專用熒光分析儀。
OchraTest 赭曲霉毒素免疫親和柱。
熒光分析儀校準溶液:稱取3.40g 二水硫酸奎寧,用0.05mol/L 的稀硫酸稀釋至100mL。
1%NaHCO3:10g NaHCO3加1000mL的純水。
甲醇:1%NaHCO3(70+30):提取液每周配制一次。
乙腈-水(60+40):600mL乙腈+400mL水。
甲醇-水(80+20):800mL乙腈+200mL水。
15%氯化鈉/2%碳酸氫鈉:150g NaCl+20gNaHCO3+1000mL純水。
2.5%氯化鈉/0.5%碳酸氫鈉:25gNaCl+5gNaHCO3+1000mL純水。
PBS:稱8.00gNaCl+1.2g Na2HPO4+0.2g KH2PO4+0.2g KCl,用990mL 純水將上述試劑溶解,然后用濃 HCl 調 pH 值至7.0,最后用純水稀釋至1000mL。
PBS/2%吐溫-20清洗緩沖液:20mL吐溫-20+980mL PBS。
PBS/0.01%吐溫-20清洗緩沖液:20mL吐溫-20+980mL PBS。
真菌毒素清洗緩沖液:將25g NaCl(氯化鈉)+5gNaHCO3(碳酸氫鈉)+0.1mL吐溫-20加入到1L 的純水中。
(2)分析測試操作步驟
①儀器標定與空白試驗
a.標定熒光計。
b.試劑空白試驗(1.55mL OchraTest 淋洗液),熒光計讀數應為0。
c.空白試驗(2mL 純水置于測試管中),熒光計讀數應為0。
②樣品提取
a.稱取25g 磨細的樣品,置于攪拌杯中。
b.加入50mL 甲醇+1%碳酸氫鈉(70:30,體積比)溶液。
c.蓋上攪拌杯的蓋子,高速攪拌1min。
d.取下蓋子,將提取物通過折疊式濾紙過濾,濾液收集于干凈的容器中。
③提取物的稀釋
a.移取10mL 上步的濾液,置于干凈的容器中。
b.用40mL PBS+2%吐溫-20清洗緩沖液將濾液稀釋,混勻。
c.將上步稀釋液通過微纖維濾紙過濾,濾液收集于玻璃注射器筒中,量取10mL。
④分離柱色譜操作
a.將上步10mL 濾液,以1～2滴/秒的流速全部通過 OchraTest 親和柱,直至空氣進入到親和柱中。
b.將10mL PBS/2%吐溫-20清洗緩沖液以1～2滴/秒的流速通過親和柱。
c.將10mL 純水以1～2滴/秒的流速通過親和柱,直至空氣進入到親和柱中。
d.用1.5mL OchraTest 淋洗液以1滴/秒的流速淋洗親和柱,將所有樣品洗脫液(1.5mL)收集于玻璃測試管中。
e.混勻后,立即將測試管置于已標定好了的熒光計中。60s后,讀數。
⑤檢測限:內推為1μg/kg。測定范圍:0～100μg/kg。