簡單來說，親和層析利用流動相和固定相內不同生物分子之間相互作用強度的差異來分離物質。
通常，在開始親和層析前需要預先進行全細胞提取物的粗制，例如細胞裂解液，生長培養基或血清。
首先將固定相裝入帶有流動相的色譜柱中，其中含有某類特定的生物大分子（從DNA到蛋白質，取決于實驗需求）。等待一段時間使兩相充分混合，隨后將洗滌緩沖液倒入色譜柱中。洗滌緩沖液通過破壞非目標生物分子與固定相的較弱結合來去除非目標生物分子。目標生物分子對固定相具有較高的親和力，因此能夠保持與固定相的結合，而不會被洗滌緩沖液沖走。然后將洗脫緩沖液倒入含有剩余目標生物分子的色譜柱中。洗脫緩沖液比洗滌緩沖液，能夠從更大程度上減弱靶生物分子與固定相之間的相互作用，從而洗脫靶生物分子。洗脫得到的溶液包含洗脫緩沖液和目標分子，稱為洗脫液。
固定相一般是凝膠基質，常見的有瓊脂糖。為了防止目標分子與配體結合過程中的空間干擾或重疊，首先將含有烴鏈的抑制劑連接到瓊脂糖珠（固體支持物）上。這種具有烴鏈的抑制劑通常被稱為瓊脂糖珠和靶分子之間的間隔基。
免疫親和層析最常見的用途是純化重組蛋白。免疫親和層析是從粗混合物中純化蛋白質或核酸的第一步的絕佳選擇。如果蛋白質的分子量，疏水性，電荷等未知，親和色譜法仍可適用于這種情況。一個典型例子是嘗試分離具有特定活性的酶時，可以用與所選底物相似或相同的連接配體構建親和柱。