在誰將成為國內側向免疫層析檢測（POCT）的巨頭？（點擊可直接進入該文章）中，曾對側向免疫層析（Lateral flow immunoassay，LFIA）檢測技術的基本原理和發展現狀做過比較系統的介紹。如今有超過一半的廠家選擇熒光作為標記探針。
其中，我們最為熟知的膠體金法試紙條就是利用顏色信號進行檢測，但其靈敏度較低，無法完全滿足實際應用的需求。因此，研究者們開發了各種納米顆粒，以改善LFIA的性能。大致可分為顏色顆粒、發光顆粒和磁顆粒三種類型（下圖）。納米顆粒的制備和修飾技術的進步，以及配套檢測設備的開發，推動著檢測信號的進化，這不僅提高了試紙條檢測水平，也是對當前市場上LFIA產品進行分類和比較的重要標準。
基于納米顆粒的各種超敏LFIA示意圖（Ref:Huang X, et al. Biosensors& Bioelectronics, 2016, 75:166-180.）
接下來我們重點看一下，在LFIA中會有哪些不同類型的納米顆粒？它們會有怎樣的應用以及原理是什么？
有色納米顆粒系列
之
金納米顆粒/GNPs
目前，傳統的膠體金法試紙條具有判讀簡單、發展成熟等獨特優勢，在市場中仍然扮演著重要的角色。金納米探針在T/C線上累積顯色，可用肉眼直接判讀。但這種方法僅能提供定性或半定量的檢測結果，而且用肉眼對條帶進行視覺判讀，也容易出現人為誤差。利用檢測儀器將顏色密度轉化為光密度（opticaldensity，OD），則可對信號進行準確量化。相比單獨讀取T線的OD值，讀取并計算T線和C線的OD值之比能夠更好地抵消反應時間、溫度、條帶之間差異等因素的不良影響。
受球形GNPs尺寸（通常為20-30nm之間）、信號強度等的限制，膠體金法的靈敏度偏低。控制GNPs在一定程度上聚集，制備復合體，可獲得比單個GNP的紅色更強的深紫色信號，如以氧化鐵或二氧化硅納米顆粒為核，在表面包被GNPs殼層。金/銀染色是另一種為人們所熟知的信號增強方法，金/銀離子被還原并沉積在T/C線的GNPs表面，使顏色信號增強。但該方法需要另外的染色和洗滌步驟，或者特殊設計的試紙條結構。與金/銀染色思路類似，酶催化顯色的方法也廣泛應用于生物傳感和測試，GNPs上同時標記抗體（或DNA單鏈等）和辣根過氧化物酶，免疫反應完成后加入底物顯色，實現T線信號的增強。
基于使用雙重GNPs進行信號增強的做法則是在傳統膠體金試紙條基礎上加入信號放大金探針，該探針負載有二抗或鏈霉親和素等，特異性靶向用于檢測的金探針，可有效增加T線上累計的GNPs數量，從而提高檢測靈敏度，該方法一般配合雙結合墊使用，信號放大探針和檢測探針分別固定在各自的結合墊上，被待測樣品溶解釋放后才有機會接觸和反應。
有色納米顆粒系列
之
其他納米顆粒
碳納米顆粒（膠體碳，炭黑），也是一類在肉眼觀察時即可實現定性或半定量檢測的顆粒。碳納米顆粒易于制備，性質穩定，無毒副作用，易結合，可作為金納米顆粒的替代物。值得一提的是，碳納米顆粒具有很高的信噪比，在一些研究中，即使使用肉眼觀測也能達到皮克級別的靈敏度。
另外也有文獻報道，采用膠體硒納米顆粒。這是一類肉眼可見的鐵銹色顆粒，也可作為LFIA的顯色標簽使用。但根據現有的研究結果，其靈敏度、準確度、重復性等各方面指標弱于使用其他納米顆粒的層析體系，因此應用前景不甚樂觀。
發光納米顆粒系列
之
半導體量子點
量子點（quantum dots，QDs）是一類熒光半導體納米晶體，由于具有尺寸依賴的發射光譜、激發譜寬、發射譜窄而對稱、熒光強度高壽命長、光穩定性好等一系列獨特性質，被認為是最有前景的免疫分析信號標簽之一，已被用于檢測藥物、毒素、病原體等。
利用不同激發/發射波長的QDs，可在一個試紙條上同時檢測多個指標。與傳統LFIA多個指標需要對應多個T線不同的是，基于QDs的多重檢測可在僅設置一條T線和一條C線的前提下實現。一種有趣的意在提高檢測靈敏度的做法是將未標記的高熒光產率的QDs事先固定在T線上，探針上攜帶直接或處理后使熒光淬滅的物質，層析完成后，通過QDs的淬滅程度判讀結果。QDs在生物環境中性能不夠穩定，這可能影響檢測結果的準確度。將QDs摻雜或封裝到納米珠中，可以得到增強的化學和膠體穩定性，同時也可以實現檢測信號的放大。
目前國內分別有重慶新賽亞，江蘇量點科技，南京諾唯贊，深圳金準等公司采用量子點作為標記探針，應用于LFIA當中。其中南京諾唯贊公司在其量子點熒光免疫層析平臺成功開發出高敏心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒，功能靈敏度達到0.02ng/mL，最快8min出結果，并且在2018年9月成功取得注冊證。
發光納米顆粒系列
之
上轉換發光納米顆粒/UCPs
UCPs可在低能的紅外光激發下發射高能的可見光或紫外光，具有較高化學穩定性和光穩定性，輸出波長可調諧等優點。尤其是UCPs可有效降低光致電離作用引起的基質材料的衰退，因此其長的熒光壽命（毫秒級）可以有效減少背景熒光干擾，降低信噪比。UCPs在免疫分析中的應用較晚（2000年之后），但發展較快，目前限制其應用的主要因素是量子產率低，光功率密度低的激發光源會大大降低激發效率。因此，研發高激發能的、可用于上轉發光的便攜設備是近來研究者們努力的方向。
發光納米顆粒系列
之
熒光納米顆粒
二氧化硅納米顆粒（Silica nanoparticles，SNPs）粒徑分布廣，生物相容性好，表面基團豐富易修飾。雖然自身沒有熒光，但可在材料內部摻雜各種熒光染料分子獲得熒光性能，已成功摻雜的染料分子包括但不限于熒光素、羅丹明、Alexa Fluor647、鑭系元素螯合物、聯吡啶釕等。與基于高分子的納米顆粒不同，SNPs不易聚集，染料泄露極低，非常適合免疫分析。條件適宜時，單個SNP中可以摻雜進大量的染料分子（可高達數萬），盡管有熒光淬滅的現象，但摻雜染料的SNPs仍能產生高度放大的熒光信號。SNPs內部的染料分子被保護不易受環境影響，光漂白也被最大程度降低。舉例來說，鑭系元素螯合物如銪（Eu）、鋱（Tb）、釤（Sm）、鏑（Dy）等，具有獨特的發光特性，如熒光壽命長、斯托克斯位移大、發射譜窄和原子態發光，已在低濃度待測物的免疫檢測中得到了廣泛應用，但發光弱和光漂白的影響使它們的應用受限。而將SNPs與鑭系元素螯合物摻雜，可有效增強熒光性能，提高檢測靈敏度。銪摻雜的SNPs已普遍用于時間分辨免疫熒光技術，與傳統技術通過波長分辨信號和背景不同，該技術利用熒光壽命區分二者，可獲得更好的信噪比。
聚苯乙烯納米顆粒，形貌均一，性能穩定，易于制備，價格低廉，也常用于摻雜熒光，與SNPs類似，熒光摻雜的聚苯乙烯納米顆粒與單個熒光分子相比，可產生更強熒光信號，改善LFIA的分析性能。
磁納米顆粒系列
之
磁納米顆粒
光學LFIA的定量分析主要通過儀器檢測膜材的反射光或發射的熒光來實現，這種手段只能獲取T/C線部位膜材表面產生的信號（約10μm），而免疫反應是在厚度達幾百微米整個膜中——包括膜表面和膜內——進行的，約90%的信號不能被儀器有效捕獲，被白白浪費掉。此外，和其他的光學傳感器一樣，光學LFIA容易受到鏡面反射、散射等光學作用的干擾，信號的淬滅和變化也不利于長期保存。因此，磁納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）被開發為新型的層析標簽。
與傳統LFIA不同，磁性LFIA的設備可以讀取檢測區全部的磁信號，從而實現高靈敏度的定量檢測。基于磁信號的穩定性，試紙條可以保存起來，用于重復測試核對結果，生物樣本對背景的干擾也較低。磁性LFIA的定量分析主要基于兩種策略。一是在振蕩磁場中，利用巨磁阻傳感器測量T線上所有MNPs的飽和磁化強度。巨磁阻傳感器可以設計得很小，以匹配待測顆粒的尺寸，使對單個磁標簽（single-magnetic-lable）的檢測更容易。二是在磁場中分別測量膜上不同區域產生的磁通量。
西安金磁納米是國內唯一一家采用磁納米顆粒作為免疫層析探針的。在2013年，西安金磁申請了金包磁的國家ZL，通過在磁納米顆粒包被一層金納米顆粒，能夠有效提高磁納米顆粒的穩定性和生物相容性。但是讀取磁信號的POCT磁定量免疫分析儀GM-MICTv2，是與美國QuantumDesign公司聯合開發，成本較傳統的熒光信號讀取的儀器要高不少。在一定程度上限制了其POCT的應用場景。如何能夠發揮磁納米顆粒磁信號的最大優勢，還用很長的一段路要走。
金磁納米顆粒應用于梅毒抗體的檢測示意圖
根據我們之前對市場上部分產品的統計，目前國內已經實現商業化的LFIA產品中，金探針和傳統的熒光探針仍然占據最主要的地位，雖然關于量子點和磁顆粒在LFIA中應用的研究已經有很多，但真正應用到市場中的并不多。
盡管如文中所述，不同的納米顆粒有著各種各樣的獨特優點，為LFIA的發展也做出了很大貢獻，但仍然有一些問題需要解決。例如，納米顆粒如何在保證性能的前提下實現批量生產，顆粒結合抗體時如何更好地保護抗體的生物活性和抗原結合能力，顆粒暴露在不同pH和電解質濃度的樣品中如何保證穩定性和單分散性，等等。無論如何，納米顆粒標簽的進步有望推動LFIA的發展，并在臨床診斷、食物安全檢測、環境監測等領域得到更好的應用。