實驗材料 基因組DNA
試劑、試劑盒 PCR 混合液
儀器、耗材 96孔透明板和蓋子水平離心機ABI PRISM 7700 測序系統熱循環儀統計軟件包
實驗步驟
1.96孔透明板B到H行每孔加2ul (30ng）基因組DNA，保留A行作對照—其中4孔只加2ul緩沖液作為「無 DNA」對照，余下8孔每孔加24基因組DNA作為陽性對照，兩種純合子各加4孔。
2.每孔加23ul PCR混合液，蓋上透明蓋，在水平離心機上短暫離心，用ABI PRISM 7700測序儀得到一個PCR反應前熒光讀數。使用「PlateRead」形式，確保選中Use Spectral Compensation forEndpoint 項（在Advanced Optionsinthe Instrument and Diagnostics菜單下）。
3.用下面的條件在熱循環儀上開始PCR。
1個循環：2 min 50°C
1個循環：10min 95°C(變性）
40個循環：15s 94°C(變性)
1 min 62°C(復性/延伸)
最終步驟：無限4°C(維持）
4.再次讀取熒光得到一個PCR反應后讀數。如果使用ABI PRISM 7700提供的等位基因分析（allele-calling)軟件，選用「AUelicDiscrimination」模式讀取焚光，通過算法可以自動分出基因型或通過視覺檢查進行基因分型。
如果進行大規模基因分型（如樣本數>500)，將多個孔板的樣本數據集中起來確定基因型顯得更為準確。這樣，請遵照本方案中的剩余步驟。