體外轉錄合成單鏈RNA探針

限制性內切核酸酶 RNA 聚合酶 胰腺 DNA 酶Ⅰ 模板 DNA

乙酸銨 牛血清白蛋白 DTT 乙醇 酚 氯仿 胎盤 RNA 酶抑制劑 醋酸鈉 轉錄緩沖液 rNTP 溶液

瓊脂糖凝膠 微量離心管 Sephadex G-50 離心柱 水浴

一、材料

1. 緩沖液與溶液

乙酸銨（10 mol/L）

牛血清白蛋白（2 mg/ml，組分 V，Sigma 公司）

DTT ( 1 mol/L)

乙醇

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盤 RNA 酶抑制劑（20 單位/μl）

醋酸鈉（3 mol/L，pH 5.2)

10X 轉錄緩沖液（400 mmol/L Tris-Cl ( 37℃ 下 pH 7.5)，60 mmol/L MgCl₂，20 mmol/L 鹽酸亞精胺（spermidine HCl )，50 mmol/L NaCl）

2. 酶與緩沖液

適當的限制性內切核酸酶

T3、T7 或 SP6 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶


無 RNA 酶的胰腺 DNA 酶Ⅰ (1 mg/ml)

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠（0.8%~1.0%)

4. 核酸與寡核苷酸

含 rATP、rCTP、和 rUTP 各 5 mmol/L 的 rNTP 溶液

rGTP ( 0.5 mmol/L)

模板 DNA



5. 放射性復合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 400~3000 Ci/mmol）

6. 專用設備

微量離心管（0.5 ml)

Sephadex G-50 離心柱，用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)平衡

預熱至 40℃ 的水浴

二、方法

1. 用適當的限制酶消化超螺旋質粒 DNA 制備 5 pmol 的線性模板 DNA。取一小份消化的 DNA (100 ng) 進行瓊脂糖凝膠電泳分析。如有必要，再補加限制酶繼續溫育，直至不再殘存痕量的未消化 DNA。

2. 如必須用產生 3' 突出端的限制酶如 PstI 或 SstI，則應用噬菌體 T4 DNA 聚合酶在四種 dNTP 的存在下處理消化的 DNA 片段，以除去產生的 3' 突出端。

3. 用酚: 氯仿抽提及用標準乙醇沉淀純化模板 DNA。將 DNA 溶解于水，使其終濃度為 100 nmol/L ( 如 3kb 質粒為 200 μg/ml)。

4. 將下列前六種組分溫育至室溫，在一個滅菌的 0.5 ml 微量離心管中，室溫下以下列順序混合：

模板 DNA                      0.2 pmol（3 kb 質粒為 400 ng）

無 RNA 酶的水              加至 6 μl

5 mmol/L rNTP 濃液       2 μl

100 mmol/L DTT            2 μl

10X 轉錄緩沖液             2 μl

2 mg/ml 牛血清白蛋白    1 μl

10 mCi/ml [α-³²P] rGTP  5 μl

( 比活性 400~3000 Ci/mmol)

輕彈管外壁以使各組分混合。然后加入：

胎盤 RNA 酶抑制劑（10 單位）                          1 μl

噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶（約 10 單位)  1 μl

輕敲管壁外側使反應物混合，離心 1~2s 以使所有液體沉降到管底。37℃（T3 和 T7 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶）或 40℃（SP6 噬菌體依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶）下溫育反應物 1~2 h。

5. ( 任選）如需全長轉錄物，可加入 2 μl 0.5 mmol/L rGTP，在適宜該聚合酶的溫度下再溫育 60 min。

6. 加入 1 μl 1 mg/ml 無 RNA 酶的胰 DNA 酶 I 以終止體外轉錄反應。輕彈管外壁以混合各試劑。37℃ 溫育反應混合物 15 min。

7. 加入 100 μl 無 RNA 酶的水，通過用酚: 氯仿抽提純化 RNA。

8. 將水相轉移至一個新的微量離心管，用下列三種方法中的任一方法將放射性標記的 RNA 與不需要的小分子 RNA 和 rNTP 分開：

(1) 用乙醇沉淀純化 RNA

① 在水相中加入 30 μl 10 mol/L 醋酸銨，混勻后再加入 250 μl 用冰預冷的乙醇。置 于冰上 30 min 后，在微量離心機中 4℃ 下以最大速度離心 10 min 收集 RNA。

② 小心地盡量吸去其中的乙醇，然后將管子敞開口，放置于實驗臺上數分鐘，使剩余的可見的乙醇揮發干凈。把 RNA 重溶于 100 μl 無 RNA 酶的水中。

③ 加 2 倍體積冰預冷的乙醇至小管內，將 DNA 貯存于 -70℃ 備用。

(2) 通過離心柱層析純化 RNA

① 將 Sephadex G-50 離心柱平衡于 10 mmol/L Tris-Cl 中（pH 7.5) 滅菌處理。

② 用離心柱層析純化 RNA。

③ 將洗脫的 RNA 貯存于 -70℃ 以備用。

(3) 通過凝膠電泳純化 RNA

① 準備中性聚丙烯酰胺凝膠。

② 在水相中加入適當的凝膠上樣緩沖液，通過凝膠電泳純化 RNA。

③ 通過放射性自顯影定位 RNA。

④ 用擠碎和浸泡的方法從凝膠塊中純化 RNA。

⑤ 將 RNA 貯存于 -70℃ 備用。