體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗方法！

在加入或不加入代謝活化系統的條件下，使培養的哺乳動物細胞暴露于受試樣品中。用中期分裂象阻斷劑（如秋水仙素）處理，使細胞停止在中期分裂象，隨后收獲細胞、制片、染色、分析染色體畸變。通過檢測受試樣品誘發體外培養的哺乳動物細胞染色體畸變的能力，從而評價受試樣品的致突變性及其強度。

一、材料

⒈受試樣品固體受試樣品應溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至一定濃度。液體受試樣品可直接使用或予以稀釋。受試樣品應在使用前新鮮配制，否則必須證實儲存不影響其穩定性。

⒉陽性對照可根據受試樣品的性質和結構選擇適宜的陽性對照物，應是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復的陽性結果。當不存在外源性代謝活化系統時，可使用的陽性對照物有甲磺酸甲酯( methyl methanesulphonate, MMS )、甲磺酸乙脂（ethyl methanesulpho-nate, EMS)、(mytomycin C )、乙基亞( ethyl nitrosourea, ENU)、硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）等。當存在外源性活化系統時，可使的陽性對照物有苯并（a)芘（benzo (a) pyrene，BaP )、環磷酰胺（cyclophosphamide）等。

⒊陰性對照水或水溶性溶劑，亦可使用二甲基亞砜(DMSO)，但濃度不應大于0.5%。

⒋細胞株可選用中國地鼠肺（CHL)細胞株或卵巢（CHO）細胞株、人或其他哺乳動物外周血淋巴細胞。

⒌肝混合功能氧化酶混合液（S9混合液）。

⒍0.04％秋水仙素溶液。取40mg秋水仙素溶解于100m1無菌0.85%氯化鈉溶液中，過濾除菌。

⒎0.075mol/L溶液

⒏固定液甲醇：冰醋酸=3:1，臨用前配制。

⒐吉姆薩染液取吉姆薩染料3.8g，置瑪瑙乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 ml，待完全溶解后，再加125 ml甘油，放入37℃溫箱中保溫48小時。保溫期間振搖數次，使充分溶解。取出過濾,2周后使用，作為吉姆薩染液原液。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8)混合。

⒑磷酸鹽緩沖液（1/15mol/L, pH 6.8)。使用時，取1份吉姆薩染液原液，與9份1/15mo1/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8 )混合，配成其應用液。

二、方法

⒈細胞培養與染毒。試驗需在加入和不加入S9的條件下進行。試驗前一天，將一定數量的細胞接種于培養皿（瓶）中，放C02培養箱內培養。試驗時吸去培養皿（瓶）中的培養液，加入一定濃度的受試樣品、S9混合液（不加s9混合液時，需用培養液補足）以及一定量不含血清的培養液，放培養箱中，根據細胞周期決定處理2～6小時。結束后，吸去含受試樣品的培養液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10％胎牛血清的培養液，放回培養箱，于24小時內收獲細胞。于收獲前2～4小時，加入細胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時間為4小時，終濃度為1ug/ml)。

⒉用0.25％胰蛋白酶溶液消化細胞，待細胞脫落后，加入含10％胎牛或小牛血清的培養液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000～1200r/min的速度離心5～7分鐘，棄去上清液。

⒊加入0.075mol/L KCl溶液7ml，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37℃水浴中低滲處理7分鐘，加入2ml固定液（甲醇：冰醋酸3：1)混勻，以1500r/min速度離心5～7分鐘，棄去上清液。

⒋加入7 ml固定液，混勻后固定7分鐘，以1500r/min速度離心7分鐘，棄去上清液。用同法再固定1～2次，棄去上清液。

⒌加入數滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。用吉姆薩染液染色。

⒍選擇 100個分散良好的中期分裂象，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應記錄每一觀察細胞的染色體數目，對于畸變細胞還應記錄顯微鏡視標位置及畸變類型。所有處理組、陽性和陰性對照組均需測定有絲分裂指數。每一劑量組應分析不少于500個分散良好的中期分裂象。

三、結果與分析

計算指標包括每個細胞畸變數、染色體結構異常百分率、各劑量組及對照組不同類型染色體異常數與頻率等。分裂細胞數應分別統計，一般不包括在總異常頻率中。

在下列兩種情況下可判定受試樣品在本試驗系統中為陽性結果：①受試樣品引起染色體結構畸變數的增加具有統計學意義，并有與劑量相關的增加；②受試樣品在任何一個劑量條件下，引起染色體結構畸變數的增加具有統計學意義，并有可重復性。

陰性結果的判定需在％RS<20%（即已產生明顯細胞毒性）的情況下未見染色體畸變率顯著增加時方可作出。評價時應綜合考慮生物學和統計學意義。