從RNA抽提到電泳鑒定1

RNA抽提
一，準備工作
1， 實驗器具與材料：
（1） 移液槍：1ml、200ul、10ul
（2） 吸頭：1ml、200ul、20ul
（3） 吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置200ul和20ul的吸頭一個
（4） EP管1.5ml、100ul
（5） 玻璃研磨器
（6） 容量瓶：1000ml
（7） 鹽水瓶：100ml
（8） 15ml塑料管一個（配75％乙醇用）
2， 實驗器具的處理與準備
（1） 塑料制品：（包括吸頭、EP管等）
將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過夜，然后送至高壓3 次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干），試驗前將槍頭放入吸頭臺。
（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）
先泡酸過夜，沖洗干凈后，在1‰DEPC水中泡8小時左右，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次。
（3） 金屬制品：（鑷子等）
先洗干凈，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3， 試劑配制和準備：
（1） DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用。配75％乙醇的DEPC 水的配制：100ml鹽水瓶內裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過夜，送至高壓。
（2） 75％乙醇（要在抽提時現配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3），然后放于-20℃備用。
（3） 異丙醇：放入棕色瓶
（4） 氯仿：放入棕色瓶
（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃
二，抽提時注意事項：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。
三，抽提步驟
1．勻漿化作用
取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器內加入 0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下，室溫靜置5分鐘。
2．分離階段
每1mlTrizol中加 0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分鐘。后12000rmp離心15分鐘。
3．RNA的沉淀
將上層水相轉入新的1.5mlEP管中（約400-500ul），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1小時，后12000rmp離心10分鐘。
4．RNA 的洗脫
小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現配的75%的乙醇（預冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后7500rmp離心5分鐘。
5．RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風機吹干（約30分鐘，此時RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分鐘助溶。
6，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉錄。
TRIzol法抽提總RNA細胞
組織100mg1×107
↓
加1mlTRIzol
↓細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊
勻漿（要徹底，后轉至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻15S，室溫5分鐘
↓
4℃，離心12000rmp，15分鐘
↓
轉上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400 -500μl），混勻后-20℃中1小時
↓
4℃，離心12000rmp，10分鐘
↓
棄上清
↓
加冰預冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml
↓
4℃ 離心7500rmp，5分鐘
↓
棄上清，超凈工作臺開風機干燥約30分鐘（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至 20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）
↓
立即保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉錄