從瓊脂糖凝膠(Agarosgel)中回收DNA片段

實驗概要

學會從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的基本技術。

實驗原理

限制性內切酶切割后的DNA片斷經過電泳后，按分子量大小被分開，排列在瓊脂糖凝膠中，可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的 DNA酶切片段。

主要試劑

1. 電泳緩沖液

2. 熒光染料

3. 電泳級瓊脂糖粉

4. 10′加樣緩沖液

5. DNA分子量標準(DL2000)

6. DNA凝膠回收試劑盒

主要設備

1. 旋渦混合器

2. 微量移液取樣器

3. 移液器吸頭

4. 1.5ml 微量離心管

5. 雙面微量離心管架

6. 臺式離心機

7. 瓊脂糖凝膠電泳系統

8. 微波爐

9. 恒溫水浴

實驗步驟

1. 配制TAE電泳緩沖液(10′儲存液)，10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。

2. 操作步驟

   1) 用1′TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。

   2) 在膠上選定兩個加樣孔，分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產物，電泳。

   3) 電泳結束后用刀片切下含有少量DNA酶切產物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣)，在紫外燈下找到目的DNA 帶，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。注意：含有大量DNA酶切產物的凝膠既不用加熒光染料，也不用紫外燈照射！

   4) 將做好標記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊，根據小膠條上的標記估計未染色的大膠上DNA酶切產物的位置，用刀片切下大膠中DNA產物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠)，轉移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。

   5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。

純化/回收試劑盒組成：

溶液A：6M NaClO₄，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚紅；

溶液B：3M NaAc；

溶液C：用時加入35ml無水乙醇；

溶液D：TE緩沖液。

膠回收步驟如下：

      a. 將切下的膠帶放入1.5ml離心管中，按照1：3 (膠帶重量：溶液A的體積)的比例加入溶液A；

      b. 50℃水溶10min，膠帶完全要求完全溶化，其間可振蕩助溶2～3次，待溶化后置室溫加入15μl溶液B，充分混勻；

      c. 將溶液置于離心柱中，靜置2min，10000rpm離心20s；

      d. 倒掉液體，加入500μl溶液C于離心柱中10000rpm離心20s，棄液體，重復該步驟一次；

      e. 12000rpm離心1min，甩干剩余液體以除去殘余乙醇；

      f. 將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋放置5～10min，使乙醇揮發殆盡；

      g. 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，靜置2min；

      h. 12000rpm離心1min，管底溶液即為所需DNA，將DNA貯存于-20℃可長期保存。